Nat Commun | 纳米孔测序技术新突破：首次在单分子水平同步解析tRNA序列、化学修饰与氨酰化状态

转运RNA（tRNA）是生命活动中不可或缺的“分子桥梁”——它的一端携带特定氨基酸，另一端的反密码子与mRNA上的密码子配对，将遗传信息精准转化为蛋白质。然而，tRNA的功能远不止于此：其分子上密集的化学修饰（平均每个tRNA含13种修饰）会显著影响其稳定性、氨酰化效率及解码能力；同时，tRNA的氨酰化状态（是否携带正确氨基酸）会随环境变化（如营养匮乏、应激反应）动态调整，直接调控细胞对压力的响应。

长期以来，科学家对tRNA的研究面临两大瓶颈：

其一，传统方法难以同时分析tRNA的序列、修饰和氨酰化状态。例如，基于短读长测序的技术需通过化学处理选择性标记未氨酰化的tRNA，但修饰会干扰逆转录酶的读取，导至信息丢失；

其二，单分子水平的解析能力不足。tRNA的氨酰化状态（携带氨基酸与否）及具体携带的氨基酸种类，一直是传统测序技术的“盲区”。

为解决这一难题，科罗拉多大学等机构的研究团队开发了“aa-tRNA-seq”技术，其核心思路是通过化学连接“锁定”氨酰化tRNA的氨基酸，再利用纳米孔测序直接读取其分子信号。

• 关键步骤一：化学连接“标记”氨酰化tRNA

研究团队利用一种名为“splinted ligation”（夹板连接）的化学技术，设计了一种5’-磷酰亚胺酯激活的适配体（adapter）。当氨酰化tRNA（携带氨基酸）存在时，其α-氨基会与该适配体反应，形成稳定的共价键；而未氨酰化的tRNA因缺乏α-氨基，无法发生此反应。这一过程如同给氨酰化tRNA“贴标签”，使其能与其他tRNA区分。

• 关键步骤二：纳米孔测序“读取”分子信号

通过优化的适配体设计和连接条件，研究人员成功将氨酰化tRNA转化为适合纳米孔测序的文库。纳米孔测序技术通过检测RNA分子通过纳米级孔道时产生的离子电流变化，直接读取其序列信息。而氨酰化tRNA因携带氨基酸，其通过孔道时的电流信号与未氨酰化tRNA存在显著差异——这一差异成为识别氨酰化状态的“分子指纹”。

• 关键步骤三：机器学习“解码”氨基酸身份

为进一步识别tRNA携带的具体氨基酸（共20种蛋白原性氨基酸），研究团队利用递归神经网络（RNN）训练模型，分析纳米孔测序信号的电流变化和停留时间（dwell time）。实验显示，不同氨基酸因分子大小、疏水性等特性，在通过纳米孔时会产生独特的信号特征。基于此，模型能以高准确率（平均F1分数0.86）区分不同氨基酸的氨酰化tRNA。

通过aa-tRNA-seq技术，研究团队在多个生物学场景中验证了其有效性：

1.营养应激下的tRNA动态：当酵母细胞缺乏亮氨酸时，携带亮氨酸的tRNA（Leu-tRNA）氨酰化水平显著下降（约28.4%），而携带丙氨酸的tRNA（Ala-tRNA）氨酰化水平却意外升高（最高3.97倍）。这一发现挑战了传统认知——此前认为营养匮乏会导至大多数tRNA氨酰化水平下降，而新结果表明特定tRNA可能通过“补偿机制”维持蛋白质合成。

2.tRNA低修饰与快速降解（RTD）的关联：在缺乏tRNA修饰酶（如TRM8、TRM4）的酵母突变体中，特定tRNA（如Val-AAC）因修饰缺失变得不稳定，易被核酸酶降解。aa-tRNA-seq不仅证实了这一过程（Val-AAC丰度下降约3.6倍），还揭示其氨酰化水平同步降低（约3.3倍），表明修饰缺陷可能通过影响氨酰化状态加速tRNA降解。

3.单分子水平的氨基酸识别潜力：研究团队利用机器学习模型，成功区分了20种氨基酸的氨酰化tRNA信号（如区分甘氨酸与赖氨酸的F1分数达0.92）。这一能力有望直接检测tRNA的“误氨酰化”事件（如携带非对应氨基酸），为研究氨酰-tRNA合成酶的功能异常提供新工具。

aa-tRNA-seq的核心优势在于单分子水平的多维度解析。它不仅能同时检测tRNA的序列、修饰和氨酰化状态，还能在活细胞环境中实时观察这些属性的动态变化。业内专家认为，该技术的突破将为以下领域带来变革：

• 基础研究：解析tRNA修饰与氨酰化的关联机制，阐明其在翻译调控、应激响应中的作用；

• 疾病诊断：检测癌症或神经退行性疾病中tRNA的异常修饰或氨酰化状态，开发新型生物标志物；

• 合成生物学：设计人工tRNA，优化其氨酰化效率和稳定性，用于高效蛋白质合成。

当然，技术仍有改进空间。例如，当前方法对部分氨基酸（如天冬酰胺、半胱氨酸）的信号识别存在偏差，需优化适配体设计；此外，绝对定量氨酰化水平仍受限于测序偏差（如氨酰化tRNA的转位速度较慢，导至采样不足）。研究团队表示，未来将通过整合转位时间信息、改进机器学习模型，进一步提升技术的准确性和通用性。从“读基因”到“读功能”，aa-tRNA-seq标志着tRNA研究进入单分子功能解析的新时代。随着技术的完善，科学家有望更深入地理解生命最基础的分子机制，为疾病治疗和生物工程提供全新视角。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-62545-9