数字PCR（ddPCR） 作为第三代PCR技术，以其绝对定量能力和高灵敏度，在基因残留检测、低丰度突变筛查等领域发挥着关键作用。与传统的实时荧光定量PCR（qPCR）不同，ddPCR不依赖标准曲线，而是通过将反应体系分割成数万个纳升级微滴，进行终点法检测后，统计阳性微滴数量来实现绝对定量。这一过程中，如何准确区分每个微滴的“阳性”与“阴性”状态，即阈值的确定，成为决定实验结果准确性的核心环节。 确定阈值的基础，在于深刻理解微滴在检测结束后呈现的荧光信号形态。理想的实验中，微滴的荧光信号应泾渭分明地形成两个紧密的集群：一个是不含目标序列的阴性微滴群（阴性云），荧光信号强度低；另一个是含有目标序列的阳性微滴群（阳性云），荧光信号强度高。然而，在实际操作中，我们常常会观察到在两个主集群之间，散布着一些荧光强度介于两者之间的微滴，形成一片弥散的、像“雨”一样的区域，即所谓的“雨滴”或中间态荧光微滴（intermediate flurescene）。 本文将聚焦于ddPCR实验中的微滴荧光形态，特别是深入探讨“雨滴”现象，旨在帮助实验人员理解其成因，并为后续选择科学的阈值划定方法奠定基础。 01 实际检测中的微滴荧光形态类别 在ddPCR实验完成后，仪器（如Bio-Rad的QX200）会测量每个微滴在两个荧光通道（如FAM和HEX/VIC）中的信号强度，并以散点图或一维直方图的形式呈现。根据荧光信号的聚集特征，微滴通常可被划分为三类清晰的形态： 阴性云 阴性云由不含目标DNA模板的微滴组成。这些微滴在PCR扩增过程中，引物和探针无法结合并产生荧光信号，其检测到的荧光强度主要来源于背景噪音、仪器本底以及可能存在的非特异性荧光。因此，阴性云的微滴数量最多，在一维散点图上聚集在靠近横坐标区域，形成一个密集、紧凑的集群。其荧光信号值低且波动范围小，分布集中。 图1来源：https://doi.org/10.3390/applmicrobiol1010007 阳性云 阳性云由含有一个或多个目标DNA模板的微滴组成。根据泊松分布原理，大部分阳性微滴含有1个拷贝的模板。在PCR扩增后，这些微滴内积累了大量的扩增子，报告荧光基团与淬灭基团完全分离，产生强烈的荧光信号。因此，阳性云在散点图上远离阴性云，聚集在荧光强度较高的区域，同样形成一个相对密集和紧凑的集群。在理想情况下，含有2个或以上模板拷贝的微滴，其荧光强度会略高于只含1个拷贝的微滴，但在常规分辨率的图表中，它们通常与单拷贝微滴混合在一起，共同构成阳性云。 雨滴 “雨滴”是指那些荧光信号强度既不属于典型的阴性云，也不属于典型的阳性云，而是落在两者之间过渡区域的微滴。在散点图上，这些点不像阴阳性云那样聚集成紧实的“云团”，而是呈现为弥散的、连续的带状或片状分布，仿佛在阴阳性云之间下了一场“雨”，因此得名。这是中间态荧光的典型表现。 “雨”的存在使得阴阳性集群的边界变得模糊，给阈值的自动或手动划定带来了巨大挑战。简单地在阴阳性云中间画一条直线作为阈值，会不可避免地将一部分“雨滴”武断地归为阳性或阴性，从而引入定量误差。
图2：“雨滴”（intermediate flurescene） 02 中间态荧光微滴（雨滴）形成的原因 “雨滴”现象并非实验失败的表现，而是ddPCR技术本身及复杂生物化学反应过程中的固有或常见现象，尤其在基质或者成分复杂的环境样本（比如土壤、血液）中普遍存在。理解“雨滴”形成的原因是正确应对它的前提。主要原因可归纳为以下几点： 这是形成“雨滴”的最主要原因。理论上，阳性微滴内的PCR扩增应达到平台期，荧光信号饱和。但现实中，某些微滴内的扩增可能因以下原因而效率不足： 抑制剂残留：样本中可能携带的蛋白酶、血红蛋白、离子螯合剂等PCR抑制剂，在微滴分割过程中被随机分配。含有抑制剂的阳性微滴，扩增效率降低，最终荧光强度达不到饱和水平。 模板质量不佳：部分降解或损伤的DNA模板，虽然能被引物结合并启动扩增，但延伸效率低，导至扩增循环数增加，终点荧光信号减弱。 反应条件次优：微滴内微环境的细微差异（如pH、盐离子浓度）可能影响酶活性，尽管这种差异在均质化良好的体系中已尽可能减小。 当目标DNA模板浓度极低时，根据泊松分布，大部分阳性微滴含有1个拷贝，但也会有少量微滴恰好含有1个拷贝的模板，而其相邻微滴为空。在数据分析时，这些“边缘”微滴的信号可能因为临近阴性云而被感知为偏弱。更重要的是，在模板浓度接近检测下限时，扩增的随机性（如引物结合、酶作用的随机性）会被放大，导至信号波动增大，产生弥散分布。 尽管探针法（如TaqMan）具有很高的特异性，但仍无法完全杜绝微弱的非特异性扩增或引物二聚体的形成。这些非目标产物也会产生荧光信号，但其强度通常远低于特异性扩增。含有非特异性产物的微滴，其信号可能略高于纯粹的阴性背景，从而落入“雨”区。 虽然ddPCR系统致力于生成均一的微滴，但实践中仍有极少数微滴会发生合并，形成“双倍”或更大体积的微滴。一个合并微滴如果由一个阴性微滴和一个弱阳性微滴合并而成，其平均荧光强度就可能表现为中间值。同样，体积偏大的微滴含有更多的反应试剂，其背景荧光可能略高；体积偏小的微滴，即使含有模板，总荧光产物量也可能略低。 荧光检测过程本身存在光电噪声和读数波动。对于信号强度刚好在阈值附近的微滴，这种仪器噪音可能足以使其信号值在临界点上下徘徊，表现为“雨”。此外，液流的不稳定性也可能导至信号瞬时波动。 综上所述，“雨”的本质是一个连续谱系，它反映了从“完全未扩增”到“完全饱和扩增”之间所有可能的状态。它不是一个错误，而是一个需要被客观识别和恰当处理的真实数据组成部分。 03 如何处理中间态荧光微滴 正确处理“雨”是获得可靠定量结果的关键。武断地忽略或随意归类都会带来偏差。目前，主流的方法和策略如下： 1. 111111111111111 这是最根本的方法。通过以下措施，可以显著压缩“雨”的宽度和密度，使阴阳性云分离更清晰： 模板纯化：使用高质量的核酸提取试剂盒，尽可能去除样本中的PCR抑制剂。 优化反应体系：对引物/探针浓度、镁离子浓度、退火温度等进行梯度优化，找到特异性最高、扩增效率最好的条件。 使用优质试剂：选择扩增效率高、抗抑制剂能力强的热启动DNA聚合酶。 规范微滴生成与操作：确保微滴生成仪工作状态良好，避免剧烈震荡或温度剧烈变化导至微滴破裂或合并。 2. 111111111111111 当“雨”无法完全消除时，需要借助数据分析软件进行客观处理。以Bio-Rad QuantaSoft软件为代表的工具，通常提供以下功能： 手动阈值设定：用户可以直观地在散点图或直方图上拖动阈值线。这种方法简单直接，但高度依赖操作者的经验，主观性强，重复性差。 自动阈值：软件基于所有微滴荧光信号的分布，自动计算并放置一条阈值。这种方法减少了主观性，但对于有明显“雨”区的数据，自动阈值可能不稳定。 “Define the Rain”功能：这是处理中间态荧光的高级工具。其核心原理是聚类分析算法，很可能是高斯混合模型。 工作原理：该算法不预先假设只有阴/阳两类，而是认为数据可能来自多个群体（例如：阴性群、阳性群、中间群）。它通过数学模型（如多个高斯分布的组合）自动寻找数据中自然形成的聚集中心，并将位于中间、分布离散的群体识别为“雨”。 结果：软件会划定出“雨”区的边界。用户可以选择将“雨”内的微滴排除在计数之外，仅使用高置信度的阴性和阳性微滴进行浓度计算。这比简单地用一条直线分割更为科学和合理，因为它承认了中间态群体的存在，并对其进行了隔离处理。 对于关键样本，可以尝试对比使用不同阈值处理方法（手动、自动、Define the Rain）得到的结果，评估其差异，以判断结果的稳健性。 04 结语 ddPCR中的“雨”现象，是连接理想技术与复杂现实的一道桥梁。它提醒我们，生物测量本身包含着连续性和不确定性。将“雨”简单地视为需要消灭的“噪音”或许过于片面，更科学的视角是将其视为数据本身的一个信息丰富的组成部分。通过优化实验减少其影响，并利用如聚类算法等智能工具对其进行客观识别和隔离处理，我们才能更逼近真实的模板浓度，充分释放ddPCR技术高精度与高灵敏度的潜力。 |
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