突破传统！新型 SidBait 技术，精准捕获小分子与蛋白的 “隐秘互动”

1. 技术设计思路

利用 SidE 的 PDE 域底物特异性低、ART 与 PDE 活性可解耦的特点，构建模块化融合蛋白，实现对小分子 / 蛋白质邻近靶标的共价捕获，命名为SidBait。

2. 具体构建策略

构建6xHis-Ub-Avi-SNAP-Ub融合蛋白（Ub 的二甘氨酸基序突变为二丙氨酸，避免被宿主泛素化机制识别），与 SidE 的 ART 域（SdeA⁵¹⁹⁻¹¹⁰⁰）和生物素连接酶 BirA 在大肠杆菌中共表达，经 Ni-NTA 纯化后，通过完整质谱证实融合蛋白被2 个 ADP - 核糖修饰和1 个生物素标记，即为成熟的 SidBait；其中 SNAP 标签可共价偶联含氯嘧啶（CLP）的小分子，Avi 标签用于亲和纯化。

3. 技术核心流程

4. 技术核心优势

   ①模块化：可替换 SNAP 标签为目标蛋白（POI），同时鉴定小分子和蛋白质靶标；

    ② 共价连接：pR 键实现诱饵与靶标的稳定交联，严苛洗涤可降低背景和假阳性；

   ③ 参数可调：孵育时间、温度、诱饵浓度等可灵活优化；

   ④ 无亚细胞定位限制：可作用于细胞裂解液中所有蛋白，适合脱靶蛋白鉴定。

1. 小分子靶标鉴定验证

合成alisertib、BI2536、dasatinib的 CLP 衍生物，分别与 SidBait 偶联后孵育细胞裂解液，LC-MS/MS 成功富集到三种药物的已知靶标（AURKA/ACAD10、PLK1/BRD4、SRC/ABL2），且游离药物可竞争性抑制探针与靶标的结合，证实技术的特异性。

2.  蛋白质相互作用鉴定验证

将 SidBait 的 SNAP 标签替换为Tpx2¹⁻⁴³、HopBF1、p38β，孵育 HEK293 裂解液后，成功富集到各自的已知互作蛋白（AURKA、HSP90、MAP2K4），证实技术可用于鉴定蛋白 - 蛋白相互作用，包括酶 - 底物相互作用。

1. 靶标发现

利用 SidBait 鉴定临床批准的 CDK4/6 抑制剂瑞博西尼（ribociclib） 的靶标，在 HEK293、心肌细胞、MCF7 裂解液中均富集到CaMKII 亚型，优化孵育时间（72h）后也能富集到预期靶标 CDK4。

2. 功能验证

① 体外活性实验：瑞博西尼抑制 CaMKIIδ 的IC50=153nM，而抑制 CDK4/6 的 IC50 仅为 2nM；

②  细胞实验：瑞博西尼可抑制心肌细胞内源性 CaMKII 活性，且使心肌细胞搏动率显著下降；

③  结构分析：解析 CaMKIIδ 激酶域与瑞博西尼的共晶结构（分辨率 2.35Å），证实瑞博西尼结合 CaMKII 的活性位点，与 CDK6 的结合模式相似，Leu92（CaMKII）替代 His100（CDK6）是其结合亲和力较低的原因。

3. 临床意义

瑞博西尼治疗乳腺癌患者出现的心血管副作用（如长 QT 综合征），或与 CaMKII 的抑制相关，为药物优化提供了方向。 

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