血液游离 DNA 甲基化肿瘤标志物实验室检测与临床应用专家共识（2025 版）

【摘要】 随着个体化医疗的快速发展，血液游离 DNA（cfDNA）甲基化肿瘤标志物在临床诊疗中的重要性日益凸显，但其应用范围和实验室检测尚缺乏统一标准 。本专家共识参考最新研究发现，结合国内外临床实践，对血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物的基础理论、实验室检测以及临床应用等方面进行全面梳理，提出专家意见并深入讨论，形成检测应用的共识推荐 。本共识旨在为 cfDNA 甲基化这一新兴肿瘤标志物的临床实践提供参考，以提升临床相关人员对其重要性和适用性的认识，从而促进其在精准医学中的健康规范发展。

【关键词】 DNA 甲基化 ；  肿瘤 ；  生物学标记 ；  临床实验室技术

DNA 甲基化作为一种表观遗传调控机制，在基因表达调控中发挥重要作用，同时也是肿瘤发生发展的重要分子标志［1‑2］。肿瘤 DNA 甲基化标志物在肿瘤筛查、辅助诊断及预后评估等临床实践中展现出应用潜力 。随着液体活检的快速发展，采用体液分析个体的癌症分子特征成为热点 。血液标本取样便捷、存储方便，能够相对广泛地反映身体的生理病理状况，是临床检验应用最为广泛的标本类型。 基于血液游离 DNA（circulating  free  DNA， cfDNA）甲基化的肿瘤标志物，因其具有高灵敏性、非侵入性、可溯源、可动态监测等优势，在液体活检领域展现出广阔的应用前景［3］。 目前国内外针对血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物检测，尚未形成统一的临床应用规范与标准化检测体系，这在一定程度上制约了该技术在临床场景中的规范化推广与应用。

为提高临床对血液 cfDNA甲基化检测重要性的认识，促进该领域的标准化发展，中华医学会检验医学分会基于最新的研究发现和临床实践编写了本专家共识。该共识系统介绍血液cfDNA甲基化肿瘤标志物的基本概念、实验室检测技术以及临床应用等内容。由于目前已获得我国国家药品监督管理局（NationalMedical Products Administration，NMPA）批准的血液cfDNA甲基化标志物均基于聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）检测方法，故本共识的核心内容主要聚焦于基于PCR的cfDNA甲基化实验室检测。本共识旨在为临床医生及检测人员提供关于血液cfDNA甲基化肿瘤标志物检测及其临床应用的指导性建议，促进临床检测规范化，为肿瘤筛查、辅助诊断以及预后评估等临床应用提供依据。

本共识的编写工作组由 33位专家组成，成员涵盖共识制定指导专家、主要执笔人及共识专家组。团队以两位检验医学领域的指导专家为核心，吸纳多名以临床检验诊断背景为主的资深专家学者共同构建共识制定委员会。在共识指导专家的指导下，由执笔人构成的工作组以临床检测需求为导向分析讨论，确定初始的拟解决的临床问题并形成优先问题列表，初步确定本共识应用范围。而后根据确定的主题和适用范围进行临床调研和初步证据检索。检索数据库包括PubMed、Web  ofScience、theCochraneLibrary、GoogleScholar、中国知网、万方数据库、维普数据库等英文和中文数据库    英文检索主要关键词包含“blood  circulating free    DNA” “circulatingfreeDNA” “cfDNA” “methylation” “cfDNAmethylation” “cancer” “tumor” “carcinoma” “neoplasm” “diagnosis” “detection” “prognosis” “screening”等，并以逻辑符号组合相关检索式。中文检索主要关键词包含“血液游离DNA” “游离DNA” “甲基化” “游离DNA甲基化”“肿瘤”“癌症”“诊断”“筛查”“预后”等，亦以逻辑符号组合相关检索式。纳入研究类型主要为系统综述、Meta分析、随机对照试验和队列研究、病例对照研究等高质量观察性研究。检索时间均为建库至2025年8月。在完成系统的证据检索后，采用预先设计的筛选流程对所有文献按照证据质量等级从高到低依次筛选和评价。在此基础上，执笔人结合专家组意见完成证据总结并起草初稿。初稿经指导专家研讨后提炼和形成初步共识。通过线上专家研讨会，组织专家组成员对共识的推荐意见进行投票，最终形成推荐等级。本专家共识参考推荐分级的评估、制订与评价系统将循证医学证据划分为“高、中、低、极低”4个等级：高级证据对效应估计值有很强信心，真实效应与估计值非常接近；中级证据对效应估计值有中等信心，真实效应可能接近估计值，但仍存疑；低级证据对效应估计值信心有限，真实效应可能与估计值有较大差异；极低级证据对效应估计值几乎没有信心，真实效应很可能与估计值显著不同。初步推荐建议经过专家投票，根据专家投票结果将推荐等级分为强推荐、推荐和未达成共识3个级别，若投票同意率超过90%视为强推荐，70%~90%视为推荐，否则为未达成共识。

一、血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物概述

DNA 甲基化是指在DNA  甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的催化作用下，将甲基基团添加到DNA分子中特定碱基（在真核生物中主要是胞嘧啶）上的过程。它是一种重要的表观遗传调控机制，可以在不改变基因序列的情况下选择性增强或沉默特定基因表达，从而导至相应的生物学功能改变。DNA的甲基化修饰调控通常发生在基因启动子区域的CpG二核苷酸位点。CpG岛甲基化水平下降，往往促进基因的转录和表达，而CpG岛甲基化水平上升，则更倾向于抑制基因的表达［4］。DNA甲基化异常是肿瘤发生与演进过程中出现最早且生物学意义最为关键的表观遗传学改变之一，该类异常甲基化事件贯穿于肿瘤发生、发展的各个阶段。

cfDNA 是细胞内核酸片段通过坏死  凋亡或细胞的主动释放进入体液的短链DNA（150~200 bp）［5］。血液 cfDNA 甲基化标志物检测是肿瘤液体活检的主要方法之一，与传统的肿瘤标志物相比，这类标志物具有更高的敏感度和特异度，同时还兼具无创、早期、精准等优点，被广泛用于肿瘤筛查、辅助诊断、预后评估等领域的临床研究［5］。近年来，国内外已有多款基于血液 cfDNA 甲基化的肿瘤检测商品化试剂盒相继获批上市，推动了该领域的临床转化与应用进程［6］。

二、血液 cfDNA 甲基化标志物的实验室检测

1. 血液 cfDNA 甲基化检测的实验室要求：血液cfDNA 甲基化检测需在具备开展临床基因扩增检验项目能力资质的医学检验实验室中开展 。实验室应遵循《医疗机构临床基因扩增管理办法》（卫办医政发〔2010〕194 号）的要求，参考 ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则》，建立并运行科学的质量管理体系，严格落实检验前、中、后各阶段的质量管理措施 。实验室还应依据《中华人民共和国国家标准实验室生物安全通用要求》《危险化学品安全管理条例》和《医疗卫生机构医疗废弃物管理办法》等相关文件，制定严格的安全防护措施。

实验室布局上应分别设立试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区等区域，各区域的气压、温度、湿度等环境参数应严格按照仪器设备的最适工作条件设定，且在物理空间上相互独立，避免污染 。实验室整体设计按照“各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作 ”的基本原则，配备满足开展 cfDNA 甲基化肿瘤标志物检测所需的仪器设备 。如果实验室同时开展了 cfDNA 和细胞基因组 DNA 检测，应设置不同的样本制备区，降低高浓度核酸对低浓度 cfDNA 检测的污染风险 。配备稳压的连续不间断电源 ，以确保仪器检测性能的稳定。

推荐在NMPA 批准的仪器设备上优先选择NMPA批准的试剂开展血液cfDNA甲基化肿瘤标志物检测。仪器使用前需经过质检，使用后需根据情况定期校准，校准频率一般为1年1次。每批试剂应进行质检，试剂批次间差异合格方可投入使用。注意保存相应的校准和质检记录。

共识 1    血液 cfDNA 甲基化检测需在具备开展临床基因扩增能力资质的医学实验室中开展。实验室各区域在物理空间上需相互独立，避免污染。若实验室同时开展血液 cfDNA 和细胞基因组DNA 检测应设置不同的样本制备区以降低污染风险（高级证据，强推荐）。

2. 实验室体系构建：血液cfDNA甲基化检测实验室应按照实际情况建立适宜的质量管理体系，并按相关要求撰写规范化文件，包括质量手册、实验室安全手册、人员管理规定、项目标准操作流程（standardoperatingprocedure，SOP）、工作日志等。cfDNA甲基化肿瘤标志物的检测流程包括分析前、分析中和分析后3个阶段，质量控制需贯穿检测的所有环节，各环节还应设立严格的防污染措施。项目开展前，应建立相应的程序文件，包括对场所、人员、设备、质控、试剂耗材等多个要素的管理控制程序。此外，应规范和严格执行开展项目的所有SOP文件。比如，分析前阶段，应制定样本采集、运输、前处理和保存等措施。分析中阶段，应详述cfDNA提取、转化、检测分析等步骤。分析后阶段，应制定结果报告和解读咨询的相关SOP。此外，实验室可根据实际情况，制定开展项目的室内质控及实验室间比对的相关SOP。开展血液cfDNA甲基化肿瘤标志物的临床检测前，还应进行性能验证，明确项目的分析性能和检测的局限性。评价方法可参考《分子诊断检验程序性能验证指南》（CNAS‑GL039）和试剂盒说明书，评价指标至少包括准确性、精密度、检测限等。

共识 2    血液 cfDNA 甲基化检测实验室应针对血液 cfDNA 甲基化检测的各个关键环节，建立健全质量管理体系以规范分析前、分析中及分析后的操作流程。开展血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物的临床检测前，应对检验全流程进行严格的性能评估和验证（高级证据，强推荐）。

3. 实验室人员要求：实验室负责人应具有临床医学专业背景、3 年以上分子诊断相关工作经历、高级专业技术职称 。所有从事人员应经过有资质的卫生机构培训，并取得基因扩增实验室技术人员培训合格证书 。检测报告出具人员需具备中级及以上临床医学检验技术资格或主治及以上病理、检验医师资格，且拥有1 年及以上分子诊断相关工作经历 。 同时建议其具备临床医学、分子生物学、遗传学等相关专业背景或接受过相应专业培训 。鉴于甲基化检测流程区别于常规基因扩增操作，相关操作人员上岗前需接受基因甲基化检测专项培训，经理论知识与实操技能的系统培训及考核合格后，方可独立开展血液 cfDNA 甲基化标志物检测工作。需定期组织开展操作人员的技能考核，考核范围包括但不限于自动化检测设备的规范使用   建议每6 个月开展一次人员考核与能力评估；新上岗人员在入职初始 6 个月内，宜完成 2 次能力评估。

共识 3    血液 cfDNA 甲基化检测的实验室人员需经过有资质的卫生机构培训，并取得基因扩增实验室技术人员培训合格证书，经理论和操作技能考核合格后方可上岗。报告人员还应具备中级及以上临床医学检验技术资格或主治及以上病理、检验医师资格，以及 1 年以上分子诊断相关工作经历。建议定期对相关检验人员进行能力评估与考核（中级证据，强推荐）。

4. 样本采集、运输及前处理：血清制备过程中的凝血反应易产生大量DNA碎片，升高检测背景噪音，因此血液cfDNA甲基化肿瘤标志物检测通常优先采集血浆样本。采血管抗凝剂推荐选用乙二胺四乙酸；肝素可抑制PCR反应，干扰检测结果准确性，故不建议采用肝素类抗凝剂［7］。鉴于cfDNA易发生降解，建议采用含细胞保护剂的专用抗凝管（如Streck采血管、游离DNA保存管等）开展样本采集。外周血采集量需符合检测项目技术要求，常规采集量为5~10 ml。采血后应轻柔颠倒采血管8~10次，使抗凝剂/保存剂与血液充分混匀，避免样本发生凝血、溶血或降解［8］。血浆样本若存在明显溶血、黄疸、脂血等异常情况，可能干扰检测结果，建议重新采集样本［9］。采样人员需具备医学检验技术资格证、医师或护士执业证，且通过专业培训并考核合格后方可上岗。

血液采集后尽快送至检测实验室处理，不得冰冻血样 。样本运输时应轻拿轻放，减少晃动等机械应力引起的细胞破裂风险。有研究显示，气动管道运输可能会增加cfDNA被细胞基因组DNA污染的风险［10］。采用普通抗凝采血管时，建议采血后2h内（不宜超过4~6h）完成血浆分离，如果不能及时处理，血样在2~8℃保存不超过24 h；如果采用含细胞保护剂的cfDNA专用采血管时，血样一般可在室温下保存3~7d［8，11‑12］。实验室应根据实际情况制定血样的保存运输和温度要求。

建议在 2~8℃下采用两步离心法分离血浆，具体离心力等参数根据项目检测要求确定，注意不得使用离心机的刹车（急停）功能，以防止血细胞层被破坏。一般情况下，第1 步于2~8℃1 500×

MSP 是在科研和临床中被广泛应用的一种经典的基因座特异性 DNA 甲基化检测方法，其基本原理是针对转化后的 DNA 进行特异性 PCR 扩增，整体流程简便、成本较低，适合单位点或少量位点的甲基化检测［21］。在临床实践中，最常采用的是基于实时荧光定量PCR平台的qMSP，目前已获批的血液cfDNA甲基化肿瘤标志物检测试剂盒大多基于该方法。MSP还衍生出巢式MSP检测、多重MSP检测、PCR熔解曲线法检测等方法。数字PCR是一类基于PCR原理的绝对定量检测技术。该技术通过将单个样本分割为大量微反应体系并分别进行PCR扩增，结合阳性微反应单元数进行泊松分布统计分析，在低丰度靶标检测场景或样本中存在PCR抑制物时，可展现出更优的检测重复性与定量精准度；目前已有基于该技术的血液cfDNA甲基化检测试剂盒获得上市批准。总体而言，以上检测方法具有高效、快捷、成本低等优势，但通量较低，适合检测单位点或少数特异性位点的DNA甲基化。

重亚硫酸盐测序（bisulfite sequencing，BS‑seq）技术能够识别单个胞嘧啶碱基位点的甲基化状态，被认为是检测DNA 甲基化的“金标准”。全基因组重亚硫酸盐甲基化测序可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱，是目前全基因组甲基化检测的主流技术［22］。在此基础上利用限制性内切酶富集CpG位点相对集中的区域进行BS‑seq的技术称为简化甲基化测序技术，该技术通过减少测序冗余提高了高CpG区域的测序深度，但可能存在覆盖区域偏倚［23］。此外，靶向BS‑seq也是常用的基于重亚硫酸盐转化的测序技术之一，可针对性地研究特定区域的甲基化状态。甲基化芯片针对预检测的CpG位点设计特异性探针，通过探针杂交靶向检测CpG位点的甲基化状态，其检测通量高、单位点成本低，但需关注批次效应、探针杂交效率等问题。基于免疫沉淀等不依赖重亚硫酸盐转化处理的二代测序技术，可有效降低检测过程中的数据冗余，且能够以区域级分辨率在全基因组范围内精准描绘甲基化序列的分布特征。cfDNA甲基化的核酸质谱检测主要基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（如EpiTYPER流程），其原理是通过检测核酸分子量的差异实现对目标位点甲基化的鉴定和分析。核酸质谱可在单个反应中检测几十个位点的甲基化状态，适合中通量DNA甲基化检测。以上检测方法可满足中‑高通量检测需求，但操作和分析复杂，成本高昂，更常用于cfDNA甲基化相关的临床前期研究，如肿瘤标志物筛选和机制研究等。

8. 数据分析与结果审核：实验室应对每批次临床样本和阴 、阳性质控及无模板对照进行同步检测，最终数据分析时质控结果应在允许的范围内。针对基于 PCR 技术的检测项目，结果判读标准如下 。阴性结果需满足内对照（如管家基因 ACTB 或GAPDH）检测结果处于阳性区间，且甲基化靶标检测结果为阴性；阳性结果需满足内对照与甲基化靶标检测结果均处于阳性区间；无模板对照需满足内对照及甲基化靶标均无明显扩增信号 。对于临床检测标本  每份样本均需设置内对照  在最终检测结果确认前，应审核各样本内对照结果是否符合该检测项目的预设要求 。若质控过程判定失败，需及时分析失败原因，并制定针对性纠正措施，以保障检测结果的准确性与可靠性。

建议血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物检测报告包括但不限于如下内容：受检者基本信息、临床诊断、样本信息（样本编号、送检单位和科室、采样时间、接收时间等）、检测方法、检测范围、检测结果、参考区间、结果说明及建议、方法局限性等，并附实验室联系方式 。建议由 2 名已获得该岗位授权的不同工作人员共同完成检测报告的审核工作；在最终结果确认阶段，需再次核查标本质量状态、检测仪器运行状态、质控结果符合性，以及检测结果与临床表征、其他检测结果的关联性等核心内容，针对异常结果或疑难结果，应根据实际情况开展复查操作 。检测结果经确认无误后，方可发放报告，且报告须由审核人员如实签署姓名 。值得注意的是，由于血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物检测的是人外周血血浆中特定基因的甲基化状态，通常情况下阳性不能作为肿瘤的确诊依据，阴性也不排除肿瘤可能，因此在报告解读和相关咨询上存在一定挑战。检测结果解读及相关临床咨询需由具备资深专业背景的人员完成；结果解读过程中，应综合考量分析前与分析中各环节的潜在影响因素，紧密结合受检者的临床实际情况，开展针对性、客观且详尽的结果阐释及相关临床咨询工作；针对复杂或特殊情形，需与临床科室进行多次沟通，必要时建立长期沟通机制。

共识 8    血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物检测结果需在满足质控标准的前提下进行分析解读。检测实验室应做好检测结果解读与临床咨询工作，以保障血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物临床应用的有效性（中级证据，强推荐）。

三、cfDNA 甲基化肿瘤标志物的临床应用

1. 血液 cfDNA 甲基化标志物应用于肿瘤辅助诊断：近年来，NMPA 相继批准了多项用于肿瘤辅助诊断的血液 cfDNA 甲基化检测试剂盒 。这些试剂盒包含的靶标和检测策略主要为单个基因检测或少数几个基因靶标联合检测；使用的检测技术均为 MSP 检测；采集的样本以血浆为主 。涉及辅助诊断的肿瘤类型包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌等，其中应用最多的为结直肠癌 。Septin9 甲基化是最早获批用于结直肠癌辅助诊断的血液 cfDNA 甲基化标志物 。其诊断结直肠癌的特异度达 90% 以上，敏感度 70%~80%［24‑27］。借助数字 PCR 等技术提升甲基化检测的检出限，可将该检测方法的敏感度提高至80% 以上［28］。并且，多靶标联合可提升标志物的诊断性能 。 目前已批准用于结直肠癌辅助诊断的多 靶 标 联 合 检 测 标 志 物 包 括 血 浆 Septin9/SDC2/ BCAT1甲基化联合检测、血浆Reprimo/SDC2/TCF4 甲基化联合检测、血浆 NTMT1/MAP3K14‑AS1 甲基化联 合 检 测  以  及  血  浆  Septin9/BCAT1/IKZF1/ BCAN/VAV3 甲 基 化 联 合 检 测 等 。 Septin9/SDC2/ BCAT1 甲基化联合检测可有效区分结直肠癌和良性息肉，其敏感度为 82.7%，特异度为 96.9%，阳性预测值可达 95.6%，联合传统肿瘤标志物癌胚抗原和粪便隐血试验可进一步提高其诊断敏感度［29］。一项临床研究表明，NTMT1 和MAP3K14‑AS1 甲基化联合检测对早期结直肠癌、进展期腺瘤、高级别上 皮 内 瘤 变 的 敏 感 度 分 别 为 87.4%、43.5% 和72.7%，提示其对不同癌前病变的检测效能具有一定的差异［30］。

除了结直肠癌，血液 cfDNA 甲基化标志物还被批准用于肝癌  胃癌  食管癌和肺癌的辅助诊断  包括用于肝癌辅助诊断的血清 BMPR1A/PLAC8 甲基化检测试剂盒和血浆 GNB4/Riplet 甲基化检测试剂盒，用于胃癌辅助诊断的血浆 Septin9/RNF180 甲基化联合检测试剂盒［31］，用于食管癌辅助诊断的血浆KCNA3/OTOP2  甲 基 化 检 测 试 剂 盒 和 血 浆MT‑1A/Epo/Septin9 甲基化检测试剂盒［32‑33］，以及用于肺癌辅助诊断的血浆 SHOX2/PTGER4 甲基化检测试剂盒和血浆 SHOX2/RASSF1A/PTGER4 甲基化检测试剂盒等［34］。对于不同肿瘤类型，这些血液 cfDNA 甲基化标志物的诊断性能差别较大，总体呈现出特异度较高（可达 85% 以上）而敏感度较低的特点 。肝脏血供丰富，是血液 cfDNA 甲基化标志物诊断效果最好的肿瘤类型之一 。血液 cfDNA 甲基化标志物联合其他筛查手段可提高检测灵敏性 。例如血液 cfDNA 甲基化标志物联合甲胎蛋白和超声可提高后两者对肝癌的诊断效能，敏感度可达87.2%［35］。

血液 cfDNA 甲基化标志物还有望应用于包括乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、血液肿瘤等多种恶性肿瘤的辅助诊断，但目前仍以临床研究为主 。同一个甲基化标志物可能在多种不同肿瘤中都具有诊断价值，例如 Septin9 除了应用于前述的结直肠癌、胃癌的辅助诊断，对肝癌、膀胱癌、宫颈癌等多种肿瘤均具 有 一 定 的 诊 断 价 值［36‑38］ 。 除 了 肺 癌 以 外 ， RASSF1A 甲基化还可能应用于乳腺癌、卵巢癌、肝癌、甲状腺癌等的辅助诊断［39‑42］。 由于消化系统肿瘤 之 间 的 相 似 性 ，血 液 cfDNA 甲 基 化 诊 断 模 型EpiPanGI Dx 对结直肠癌、肝癌、胃癌、食管鳞癌、食管腺癌、胰腺癌均表现出良好的诊断性能，总的曲线下面积为 0.88［43］，提示血液 cfDNA 甲基化在泛癌诊断中的潜在应用价值［44］。多位点预测模型可进一步提升血液 cfDNA 甲基化标志物的诊断性能 。例 如 ，包 含  100  个 甲 基 化 特 征 的 诊 断 模 型PulmoSeek 对良性与恶性肺结节的区分效果优于影像学和临床预测模型［45］。得益于组学技术与人工智能技术的快速发展，整合多维度或多组学数据、采用机器学习等人工智能方法构建诊断模型的策略，在临床研究领域的应用日趋广泛 。例如，在前述甲基化模型 PulmoSeek 基础上联合临床指标、影像学结果的多模态诊断模型 PulmoSeek Plus 可提高单独甲基化或影像学模型区分恶性肺结节与良性肺结节的准确性［46］。cfDNA 多维片段组学分析提出整合 cfDNA 的多种特征（如片段长度、甲基化模式 、基因突变 、拷贝数变 异等）来实现疾病检测［47］。研究表明，基于血液 cfDNA 多维片段组学的机器学习模型鉴别胰腺癌和对照的敏感度和特异度均可达到 90% 以上［48］。另一项研究表明，联合血液 cfDNA 甲基化和片段分析的模型 GutSeer 对 5 种消化道肿瘤总体敏感度达82.8%，特异度达95.8%［49］。此外，灵敏的检测技术也可提高标志物的诊断性能 。例如基于数字 PCR 的 4 个甲基化标志物诊断非小细胞肺癌的敏感度可达 90%，检测效能优于普通 PCR 为基础的甲基化检测技术［50］。

共识 9    血液 cfDNA 甲基化标志物是理想的肿瘤辅助诊断标志物。基于甲基化PCR 的单个或少数 cfDNA 甲基化靶标联合检测对多种肿瘤均具有较高的特异性，推荐应用于结直肠癌、肝癌、胃癌、食管癌以及肺癌等恶性肿瘤的辅助诊断。（中级证据，推荐）。

2. 血液 cfDNA 甲基化标志物应用于肿瘤筛查：肿瘤辅助诊断用于辅助鉴别疑似恶性肿瘤患者的病理状态，而肿瘤筛查旨在从健康人群或高危人群中识别出癌前病变或早期肿瘤 。DNA 甲基化改变可发生在癌变早期和癌前病变时期 。 因具有良好的特异性 ，并且具有组织可溯源等优势 ，血液cfDNA 甲基化标志物在肿瘤筛查方面具有广阔的应用前景 。血浆 Septin9 甲基化检测是最早获得FDA 批准的用于结直肠癌筛查的 cfDNA 甲基化标志物 。多中心的前瞻性筛查结果显示，其用于无症状人群结直肠癌筛查的特异度较高，为 91.5%，而敏感度不太理想，为 48.2%，尤其是对进展期腺瘤的敏感度较差，仅为 11.2%［27］。后续的多项筛查研究数据显示血浆 Septin9 甲基化对早期结直肠癌和腺瘤的敏感度不高，均低于 50% 。国内外结直肠癌筛查指南和共识均提出 Septin9 甲基化对早期结直肠腺癌和癌前病变的诊断价值有限，不推荐单独应用于癌前病变筛查［51‑53］。多基因位点甲基化联合检测有望提高肿瘤筛查的敏感度 。研究表明，基于149 个区域甲基化位点的结直肠癌筛查模型ColonSecure，在结直肠癌高危人群中筛查结直肠癌的敏感度为 86.4%，高于癌胚抗原、糖类抗原 19‑9 等常规标志物［54］。然而，多位点联合检测的实施成本相对较高，其卫生经济学效益有待深入评估。

血液cfDNA 甲基化在多癌种早期检测（multicancer early detection，MCED）领域展现出良好的应用潜力。《基于液体活检技术的多癌种联合筛查专家共识（2025）》明确指出，cfDNA 甲基化是MCED 的核心标志物［55］循环游离基因组图谱研究协作组构建的早诊模型 Galleri 在大规模病例对照研究中体现出多癌种筛查的潜力 。该模型检测50余种肿瘤的总 体敏感度为51.5%，特异度为99.5%［56‑57］。针对胃癌、食管癌 、结直肠癌、肺癌和肝癌的甲基化早诊模型 PanSeer 预测 3~4 年后恶性肿瘤的敏感度可达 95.7%［58］。一项针对无症状人群的多癌种筛查试验结果显示 cfDNA 甲基化模型筛查恶性肿瘤的总体阳性预测值为 38%［59］。然而，此类 cfDNA 甲基化筛查模型多依托二代测序或广谱多靶点检测技术构建，其操作流程的复杂性及较高的技术成本，可能限制其在全民肿瘤筛查场景中的普及应用 。 目前，血液 cfDNA 甲基化标志物应用于结直肠癌以外恶性肿瘤筛查的卫生经济学效益仍缺乏严谨的随机对照试验进行评估 。 基于Galleri 检测技术的前期研究结果，英国国家医疗服务体系与 Grail 公司联合发起一项前瞻性随机对照试验，计划在逾 14 万例无症状人群中评估 Galleri技术在真实世界场景下 MCED 的应用价值［60］。该项目的初步研究结果显示，在真实世界中，Galleri 筛查无症状人群恶性肿瘤的总体阳性预测值为 49.4%，预测肿瘤来源（包括无症状和有症状肿瘤）的准确率为 87.3%［61］，而敏感度和特异度数据尚未报道。

共识 10    血液cfDNA 甲基化标志物在肿瘤筛查，尤其是结直肠癌筛查中具有应用潜力，但对癌前病变或早期肿瘤筛查的敏感度仍不够理想。由于目前对癌前病变的敏感度不足，且缺乏大规模前瞻性研究和卫生经济学评估的证据，暂不推荐血液cfDNA 甲基化标志物单独应用于无症状人群的肿瘤和癌前病变筛查（中级证据，强推荐）。

3. 血液 cfDNA 甲基化标志物的其他应用：除了辅助诊断和肿瘤筛查，血液 cfDNA 甲基化标志物在肿瘤预后监测、用药指导及肿瘤溯源等方面具有潜在应用前景，但目前均仅限于临床研究，正式应用于临床实践尚需积累更多证据。

实 体 肿 瘤 微 小 残 留 病 灶（minimal  residual disease，MRD）检测是随着液体活检技术发展而产生的一种肿瘤动态监测方法［62‑63］。运用 cfDNA 甲基化指标进行 MRD 监测的研究策略已应用于多种实 体 肿 瘤 相关研究［64‑68］。例如，血浆 Septin9/ BCAN/BCAT1/IKZF1/VAV3 甲基化靶标联合检测能够预测结直肠癌术后复发风险，术后阳性患者复发的风险为阴性患者的 17.5 倍［64］。另一项 MRD 相关试验的研究结果显示，通过术后外周血 cfDNA 基因突变联合甲基化信号进行预测，对可手术结直肠癌患者(Ⅰ~Ⅲ期）2年无复发生存的预测敏感度为62. 1%，特异度为85.9%［65］。总体而言，血液 cfDNA甲基化相关的 MRD 研究主要采用固定位点检测策略，该策略适用于识别恶性肿瘤患者群体中对特定治疗方式无应答/低应答，或存在高复发风险的人群。

目前肿瘤用药指导相关的基因甲基化检测以组织标本为主，血液 cfDNA 甲基化检测在肿瘤用药指导中的临床应用较少 。 以预测乳腺癌内分泌治疗敏感性的靶标 ESR1 基因甲基化检测为例，研究发现，ESR1 甲基化在乳腺癌组织病理切片中的检出率为38.5%，循环肿瘤细胞中约 为 20%，而 在cfDNA 中则<10%［69］。这可能是外周血 cfDNA 甲基化在肿瘤药物治疗靶点选择的临床转化与应用中受限的原因之一。

原发灶不明的恶性肿瘤是指经常规检查与评估仍无法明确原发部位的一类异质性、转移性肿瘤病灶，其发病率约占全部肿瘤病例的 3% 。 因不同肿瘤细胞具有其特定的甲基化表观遗传修饰模式，捕获血液 cfDNA 中的肿瘤特异性甲基化修饰信息可能实现肿瘤的溯源与定位 。循环游离基因组图谱研究协作组研究显示，cfDNA 甲基化对 12 种肿瘤的溯源准确性可达 93%［70］。THUNDER研究构建的多肿瘤诊断模型 MCDBT‑1、MCDBT‑2 对 6 种常见肿瘤溯源的准确性分别达到了83.2% 和79.4%［71］。据估计，在真实世界中，该模型对肺癌的溯源准确性最低，约为 60%，而对肝癌的溯源准确性最高，可达 90% 以上 。这些研究提示血液 cfDNA甲基化检测对于肿瘤溯源的准确性在不同肿瘤类型之间差异较大，携带肿瘤特异性甲基化标记的DNA 在 cfDNA 中的含量可能是决定肿瘤溯源准确性的重要因素 。 目前肿瘤溯源主要以先验的已知原发病灶的恶性肿瘤患者为主，后续仍需积累更充分的前瞻性临床数据以切实推进 cfDNA 甲基化应用于临床原发灶不明的恶性肿瘤溯源。

共识 11    血液cfDNA 甲基化标志物在肿瘤预后监测、用药指导及溯源等方面具有潜在的应用前景，但目前临床应用尚不成熟，仍需积累更多临床证据（中级证据，强推荐）。

四、小结与展望

DNA 甲基化是最重要的表观遗传学修饰之一，其在肿瘤细胞中的异常模式可以作为肿瘤检测的有效生物标志物 。近年来多项研究提示，血液cfDNA 甲基化肿瘤标志物具备较高的检测敏感度与特异度，同时具有良好的组织溯源能力；其不仅取材便捷，还可动态反映肿瘤的生物学行为变化，在临床实践中的应用潜力主要有以下方面。（1）肿瘤筛查：在高风险人群中利用血液 cfDNA 甲基化标志物进行肿瘤筛查，有望提高早期肿瘤诊断率和治愈率；（2）辅助诊断：cfDNA 甲基化标志物可以在肿瘤早期阶段提示基因异常，为难以通过传统影像学方法检测的早期肿瘤，提供一种非侵入性的辅助诊断手段；（3）预后监测：cfDNA 甲基化水平可以实时反映肿瘤的动态变化，有助于评估治疗效果和监测疾病复发；（4）肿瘤溯源：不同肿瘤细胞具有其特定的甲基化表观遗传修饰模式，通过血液 cfDNA 甲基化标志物可对原发灶不明的恶性肿瘤进行溯源 。目前应用较为成熟的临床实践领域主要为肿瘤辅助诊断 。cfDNA 在血液中浓度低、半衰期短、背景噪音高 、丰度易受多种因素影响 ，这些特点为cfDNA 甲基化肿瘤标志物的实验室检测带来了较大挑战，在今后的研究和应用中，亟需建立系统化、标准化的实验室检测标准，通过规范化的质量管理保障检测结果准确可靠 。同时，cfDNA 甲基化检测的成本仍处于相对较高水平，且该技术在基层医疗机构的普及应用面临技术与经济双重门槛；其纳入常规医保报销范畴的可行性，仍需更多卫生经济学证据予以支撑。

当前 cfDNA 甲基化检测以前所未有的速度发展，随着分子生物学技术的不断革新，血液 cfDNA甲基化肿瘤标志物在肿瘤诊疗中的应用也有望进一步拓展，主要包括：（1）标志物的多样性与特异性：运用机器学习等人工智能方法对海量甲基化数据进行深度解析，发掘更多具有高特异性的甲基化标志物，以提高不同肿瘤类型和分期的检测准确性 。进行多标志物的联合检测或多模态数据组合建模，可提供更全面的疾病信息。（2）技术进步：新型检测技术的研发将有助于提高 cfDNA 甲基化分析的敏感度和特异度，高通量测序、数字 PCR 等技术的应用将积极推动这一领域的发展，使检测更加便捷经济。（3）检测标准化与规范化：进一步深入构建标准化的检测流程和质量控制体系，使 cfDNA 甲基化肿瘤标志物得到更广泛的临床应用。（4）标志物在人群中的异质性：通过深入研究 cfDNA 甲基化标志物的个体差异，实现更精准的个体化肿瘤筛查和治疗。

综上所述，血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物具有广阔的临床应用前景，未来的研究将进一步推动其在肿瘤诊疗中的应用，带来更加精准和个性化的临床决策方案 。本共识围绕血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物的实验室检测和临床应用进行系统梳理，为血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物的临床应用和实验室检测提供了充分的理论依据 。本共识旨在积极推动血液 cfDNA 甲基化肿瘤标志物检测领域的创新发展与学术进步，促进该技术在临床实践中的标准化建设与规范化应用，进而助力实现肿瘤的精准化管理与全程化防控，为保障广大肿瘤患者的健康权益提供有力支撑。

执笔人：李娇元（华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科），沈娜（华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科），李培龙（山东大学齐鲁第二医院检验医学中心）

共识制定指导专家：王传新（山东大学齐鲁医院检验医学中心），程黎明（华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科）共识制定专家组成员（按姓氏汉语拼音字母排列）：崔巍（中国医学科学院肿瘤医院检验科），崔丽艳（北京大学第三医院检验科），邓昆（重庆医科大学附属第三医院检验科），杜鲁涛（山东大学齐鲁医院检验医学中心），高春芳（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院检验实验中心），关明（复旦大学附属华山医院检验医学科），郭林（复旦大学附属肿瘤医院检验科），郭玮（复旦大学附属中山医院检验科），胡波（中山大学附属第三医院检验科），李冬（同济大学附属同济医院检验科），李绵洋（解放军总医院第一医学中心检验科），李明（中国科学技术大学附属第一医院检验科），刘善荣（海军军医大学第一附属医院实验诊断科），刘维薇（上海中医药大学附属龙华医院检验科），娄加陶（上海交通大学医学院附属第一人民医院检验医学中心），潘世扬（南京医科大学第一附属医院检验学部），沈立松（上海交通大学医学院附属新华医院检验科），孙成铭（烟台毓璜顶医院检验科），陶志华（浙江大学医学院附属第二医院检验科），王保龙（中国科学技术大学附属第一医院检验科），王佳谊（上海市胸科医院检验科），王小中（南昌大学第二附属医院检验科），王雅杰（首都医科大学附属北京地坛医院检验科），谢小兵（湖南中医药大学第一附属医院医学检验与病理中心），易斌（中南大学湘雅医院检验科），袁宏（大连理工大学附属中心医院临床检验中心），张钧（浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科），张义（山东大学齐鲁医院检验医学中心）

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