凝胶层析所用的层析柱为什么较其他层析方法所用的层析柱要长？

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据我所知，凝胶层析所用的层析柱是20cm，明显较其他，如离子交换所用的层析柱要长，请问这是什么原因？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/20921016

同花顺

氟树脂PFA过滤层析柱，采用进口全氟烷氧基树脂制成，半透明材质，可观察过滤情况；耐强酸强碱和有机溶剂的特点，让其可以过滤物质，也不会造成污染；内壁光滑，无粘附。



PFA层析柱

1.适用于分析纯化的产品：用于分析的样品，样品量比较少，而且对于纯度有极高的要求。所以，用于分析纯化的层析柱一般不会太高 (15–30 cm) ，上样体积在柱体积的0.3%-0.5%之间。体积小，高度适宜的层析柱可以在保证高分辨率的同时，减少运行时间，并节省样品和缓冲液的使用量。
2.适用于制备纯化的产品：相比而言，制备样品相对样品量稍大一些，对于纯度的要求较高但不必达到分析级纯度。所以，一般会选择用较高的层析柱（60 cm及以上）进行纯化，上样体积一般在柱体积的0.5%-4%。
3.适用于脱盐与缓冲液置换的产品：脱盐与缓冲液的置换，本质上就是大分子样品与小分子（离子）的缓冲液组分之间的分离。这种情况下，对于分辨率的要求相对不如前两种情况高，而且，由于分子量差异大，上样体积可以达到柱体积的30%。
常见的PFA过滤柱的尺寸：
长度*外径*内径：280*36*32mm
长度*外径*内径：300*36*32mm
长度*外径*内径：400*36*32mm
长度*外径*内径：500*36*32mm
长度*外径*内径：600*36*32mm
长度*外径*内径：700*36*32mm

长度*外径*内径：300*29*25mm
长度*外径*内径：500*29*25mm

长度*外径*内径：830*46*40mm
长度*外径*内径：600*46*40mm
长度*外径*内径：500*46*40mm
长度*外径*内径：300*46*40mm
长度*外径*内径：100*46*40mm
可串联多次层析过滤，搭配架子使用



串联PFA过滤柱

卡卡

一.实验原理

蛋白质的纯化的主要目的是要获得高纯度和高活性的目的蛋白，一般来说通用的流程包括前处理、粗分级分离、细分级分离。在前处理中，我们通常使用研磨、超声这样的物理方式或者是酶解这样的化学方式，使得细胞破裂、细胞的内容物流出。细胞内容物流出后，我们可以采用一系列的方式进行粗分级分离，通常的方法有盐析、沉淀、浓缩，这样的方法它的运载量比较大，而且成本低廉，非常适合初级分离。初级分离之后，我们要进一步得到纯品，必须进行细分级分离。在这个步骤中，我们通常采用的方法有层析和电泳。
1.粗分级分离

（1） 粗分级分离的主要目的是将蛋白质和其他生物大分子分离开，而我们利用到的最主要的性质差异，就是溶解度的不同，利用溶解度的不同，我们可以采用盐析法或者是沉淀法将蛋白质分离出来。
（2） 蛋白质沉淀过程：蛋白质的溶解实际上形成的是胶体溶液，蛋白质分子在水溶液中，水分子会包裹在蛋白质分子的外层形成水化层。因为有水化层的存在使得蛋白质分子不会过度的聚集，比较分散，那么就形成了一个胶体的均匀溶液。如果我们加入一些外界条件去破坏蛋白质分子外的水化层。比如说盐析法里面，我们利用盐离子，而有机溶剂沉淀法里，我们用的是有机溶剂分子，那么这样的一些分子，都可以通过抢夺水分子的方式去破坏蛋白质表面的水化层，从而导致蛋白质分子的互相靠近，这样的一种靠近，就使得蛋白质聚集沉淀出来了。这是粗分级分离使用的盐析法或者是沉淀法的最主要原理。



蛋白质分子的水化层




蛋白质分子的水化层被破坏

（3）有机溶剂沉淀法
①实验原理：向水溶液中加入亲水性的有机溶剂，使得蛋白质的溶解度下降沉淀出来的过程，有机溶剂沉淀法成本低，分辨率相比盐析法是比较高的，而且它最主要的优点是除去溶剂非常容易，因为我们都知道有机溶剂非常容易挥发。
②那么在有机溶剂沉淀法中影响沉淀效果的主要因素有哪些呢？
1）温度; 2)PH; 3)金属离子的存在与否; 4)目的蛋白的浓度; 5)无机盐离子强度
由于有机溶剂非常容易使得蛋白质变性失活，因此在有机溶剂沉淀蛋白质整个过程中，必须要严格地控制温度，尽可能减少蛋白质失活的机会。
③有机溶剂沉淀法实验步骤


https://www.zhihu.com/video/1500882783841366016
2.细分级分离

当我们通过粗分级分离得到了粗提取物之后，下一步要进行的就是细分级分离。我们可以通过目的蛋白与其他杂质蛋白的性质差异进行细分级分离，具体的性质包括电荷的不同。
(1) 如果目的蛋白的所带电荷与杂质蛋白有明显的差异，我们可以采用离子交换层析法、电泳法、等电聚集电泳法进行分离。
(2) 而如果目的蛋白的分子大小与杂质蛋白相差非常大的话，这个时候我们可以使用分子筛层析法、SDS-PAGE电泳法、超速离心法进行分离。
(3) 最后最精准的一种纯化方式是亲和层析法，它利用的是目的蛋白与柱层析中的固定相的亲和力大小差异进行分离的。无论哪一种分离方法，我们会发现层析法在其中都占据了非常主要的位置。
(4) 柱层析法：是基于被分离物质的物理、化学及其生物学特性的不同，使得它们在固定相和流动相之间的分配系数存在差异，即在固定相中运动速度存在差异，这就达到了分离和提纯的目的。
(5) 我们今天使用的柱层析法是分子筛层析法，它也可以称为凝胶排阻层析，固定相是凝胶，凝胶内部实际上是一个多孔的网状结构，当一些分子量很大的分子要通过这个凝胶的时候，它没有办法进入到网状的内部，因为太大了，它就会在凝胶颗粒的间隙流动，这个流动速度会比较快。而如果分子的大小刚好可以进入空隙内部的时候，那么它就会慢慢地流进凝胶的内部，所以它的洗脱速度就会比较慢。




①我们一定要记住，在分子层析中，分子量大的分子先流出，分子量的小分子后流出。下面是具体的分子筛层析的实验原理:

分子筛层析的实验原理
https://www.zhihu.com/video/1500883210116091904
②我们使用的凝胶是葡聚糖凝胶，它实际上是直链的葡聚糖分子和交联剂经过化学反应形成一个高分子的网络结构，下面是直链的葡聚糖分子结构示意图



葡聚糖凝胶




直链的葡聚糖分子结构

③当我们没有加入交联剂时，这个凝胶实际上是线状的结构，那么我们加入交联剂，就可以将两条相邻的直链葡聚糖分子通过化学键连在一起，也就是形成了网状结构。在这样的网络结构中，因为它有很多的空隙，所有它有很强的吸水性能。而吸水性能与加入的交联剂的含量有关，当我们增加交联剂时，凝胶分子的网格的线条明显增多，每一个网格的空隙变小了，这就说明能够吸水的体检变小了，所以凝胶的吸水能力和交联度是成反比的关系。


④分子筛层析的实验步骤


https://www.zhihu.com/video/1500883606663221248
二.操作示例

1. 分子筛层析

又叫凝胶过滤层析或凝胶排阻层析，它是利用待分离物质的分子量大小不同而实现的分离目的蛋白的方法，属于柱层析的一种。
（1）与其他的柱层析相似，分子筛层析所需要的仪器设备：
    ①恒流泵(可以使层析时的流速可控并且稳定)



恒流泵

②层析柱（根据提取规模不同选择规格不同的层析柱）



层析柱

2.凝胶层析柱的装柱、上样、洗脱和接收的全过程以及操作要点


分子筛层析的操作示范和要点
https://www.zhihu.com/video/1500884109241487360
三.结果处理分析与注意事项

1. 判定蛋白质提取是否成功

（1）蛋白质的收率
        我们只需要检测粗酶/精酶的重量，就可以进行判断蛋白质的收率
（2）蛋白质的活力
       我们需要比较粗酶/精酶的活力及酶活力的损耗。
（3）最后我们通过一个综合指标-酶的比活力去判定蛋白质提取是否成功。
（4）测定酶的重量
  ①对于粗酶来说，它是一个灰绿色的沉淀，它的重量非常容易测，只要称重就可以；
②对于纯酶来说，它是一个无色的溶液，我们采用考马斯亮蓝染色比色法进行蛋白质定量测定，精酶溶液含量的计算示例如下


https://www.zhihu.com/video/1500884513639473152
（5）酶的活力和比活力的测定和计算
①酶活力：是在优化条件下1min内转化1mmol底物所需要的酶量，酶的比活力是指单位重量下酶的活力。
②这里有两个关键点：


2）酶比活力：酶活力除以我们用于测定酶活力的酶重量，单位是mg,这就是酶活力和酶比活力的计算。


2.柱层析法中装柱效果的评价

我们需要绘制洗脱曲线，并且对洗脱曲线进行分析，我们绘制的洗脱曲线的纵坐标是酶活力。下面是洗脱曲线的绘制方法

洗脱曲线的绘制
https://www.zhihu.com/video/1500885125676507136

大力水手

凝胶层析用来分离大小不同的蛋白，分子量小的通过凝胶颗粒中的孔隙路径相对较长，分子量大的通过颗粒间隙路径相对短些。同样的时间，路径短的，流的快的就先出，从而达到分离的目的。简单的比喻，两人赛跑，一步之内很难分胜负，但是五十米，或者一百米就可以分出先后，所以柱子长短关乎分离效果。其它层析如离子交换层析(亲和层析)是靠跟配基结合能力强弱(特异性结合)，来达到纯化作用，装柱的长短关系着柱载量，所以柱的长短由你的你的样品量来决定。

大力水手

楼主所谓的凝胶层析柱应该指的是分子筛柱 分子筛柱影响分离效果的一个重要指标是柱子的柱效 也就是理论塔板数 而影响理论塔板数的分别是塔板高度和柱子的长度 如果塔板高度已经接近极限值时如果想要进一步提高分离效果最直接的方式也就是加长柱长进一步增加理论塔板数的绝对数量了

长长的路

交换柱，如离子交换或亲和层析，说白了可以不用柱子的，我经常在一个锥形瓶或者烧杯里做。毕竟只是交换而已嘛。。。
分子筛么，利用分子尺寸分离，自然是路径越长效果越好，1.8米效果比20厘米强的多。至于为什么看百度吧。