核酸（DNA/RNA）提取,为什么有些质控数据，不可信？

千姿百态

做核酸（DNA/RNA）检测的实验室小伙伴们都知道，在核酸提取完成后需要对产物进行质控，以确保核酸浓度与质量达到后续应用标准，如：PCR，RT-PCR，转录，测序，芯片等后续应用。
核酸（DNA/RNA）的质控方法有哪些？
一、微量紫外分光光度计（如Nanodrop）和荧光定量（如Qubit）检测核酸纯度、浓度
1、根据OD值评估核酸纯度：OD260/OD280及OD260/OD230
纯DNA的OD260/OD280比值通常为1.8(1.6-1.9)，大于2.0，表明有RNA污染;小于1.6，表明有蛋白质、酚等污染。OD260/OD230的比值可用于判断DNA样本中是否存在有机溶剂、碳水化合物等其他杂质。一般来说，纯净的DNA样本OD260/OD230的比值应大于2.0。如果比值小于2.0，可能表明存在上述杂质。
纯RNA的OD260/OD280比值通常为2.0(1.8-2.1)，低于1.8，说明有蛋白质污染;高于2.2,说明RNA降解或异硫氰酸残留。纯净的RNA样品，OD260/OD230的比值应大于2.0，表示RNA纯度高，不含显著的污染物‌。
2、测量值看核酸（DNA/RNA）浓度
Nanodrop和Qubit都可以检测核酸浓度，但Nanodrop测量值在某些情况下可能不准确，存在偏高或者假浓度的情况。


（1）由于核酸降解导致Nanodrop测量值偏高（如图一）



图一

将相同条件下的植物组织样本均分成两组，两组样本分别采用品牌C（第一组）和新百基（第二组）的植物组织DNA提取试剂盒进行提取，从Nanodrop浓度值可以看出，第一组的浓度均值大于第二组，但结合电泳图，不难发现，第一组DNA产物存在降解，Nanodrop测量值存在误差。
原因分析：Nanodrop是通过测量物质对不同波长光的吸收程度来进行分析，核酸在波长260nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分，故结果偏高。
（2）DNA中残留RNA，导致Nanodrop值偏高（如图二）



图二

将同一动物组织样本均分为三组，三组样本分别采用品牌M（第一组）、品牌G（第二组）和新百基（第三组）的动物组织DNA提取试剂盒进行提取，从Nanodrop浓度值可以看出：第二组＞第一组＞第三组，但结合电泳图，不难发现，第一组和第二组DNA产物中含有RNA，存在RNA污染，且DNA条带亮度均低于第三组。Nanodrop测量值存在误差。
原因分析：Nanodrop是通过测量物质对不同波长光的吸收程度来进行分析，核酸在波长260nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，DNA和RNA都含有共轭双键系统，紫外法不能区分DNA和RNA，所以测量值偏高，存在误差。
（3）Nanodrop测量值远高于Qubit测量值（如图三）



图三

将相同条件下的动物组织样本均分成三组，分别采用三个品牌（第一组品牌A、第二组品牌B、第三组新百基）的动物组织DNA提取试剂盒进行提取。可以看出：三组数据Nanodrop浓度均值：第一组＞第二组＞第三组，但Qubit测量均值：第一组＜第二组＜第三组，其中第一组数据中Qubit测量值比Nanodrop低大约40左右，结合电泳图，可以看出第一组Nanodrop测量值存在虚高。
原因分析：紫外分光光度计（如Nanodrop）是通过测量物质对不同波长光的吸收程度来进行分析，在特定条件下，吸光度与溶液的浓度成正比。核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测量误差较大。
荧光定量（如Qubit）采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，该技术采用只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的Molecular Probes® 染料。这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时才能发出荧光信号，因此这种特异性可以获得更准确的结果。
二、琼脂糖凝胶电泳检测核酸（DNA/RNA）质量，如下图，图四：为DNA电泳图，图五：为RNA电泳图。


所以在进行核酸质控时要进行多方位多角度检测，确保核酸产物质量达到后续检测标准。
如果比较关注核酸浓度，建议结合紫外分光光度计（如Nanodrop）和荧光定量（如Qubit）测量值进行判断；如果比较注重纯度，建议结合紫外分光光度计（如Nanodrop）和琼脂糖凝胶电泳进行判断；当然如果有条件，三者结合判断更准确。

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