一文读懂酶联免疫吸附实验（ELISA） 丨超详细-酶联生物

强强

    酶联免疫吸附实验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）是将抗原或抗体结合在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性结合以及抗体或者抗原上标记的酶催化特定底物发生显色反应，实现目标物检测的免疫分析方法，可测至皮摩尔（pmol）级别。

    技术原理

    ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

•     将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。
•     测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。
•     用洗涤的方法分离抗原-抗体复合物和游离成分。
•     加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量。
  

   

    图1：ELISA原理图

    ELISA实验中有三种必要的试剂

•     固相的抗原或抗体（用于结合到固相载体上）
•     酶标记的抗原或抗体（标记物）
•     酶作用的底物（显色剂，用于显色）
  

    ELISA常见类型

    直接法：

    将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。

   

    图2：直接法

    特点

    适用于检测小分子抗原，优势：实验步骤少，检测速度快，无须使用二抗可避免交互反应，结果较准确。缺点：每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验灵活性低，灵敏度低。

    间接法：

    将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原一待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。

   

    图3：间接法

    特点

    常用于抗体的检测，只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它多的免疫反应性。缺点：可能会发生交叉反应，与直接法比，实验周期长。

    夹心法：

    类型：分为直接夹心和间接夹心。检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。

    直接夹心又分为双抗体夹心和双抗原夹心。夹心ELISA实验需要用到配对抗体（捕获抗体和检测抗体），原理：将捕获抗体结合到ELISA板上，通过捕获抗体固定抗原，随后通过直接或间接ELISA的方式进行检测。在夹心ELISA实验中，最重要的是对配对抗体进行验证，确保配对抗体能同时与抗原结合，以确保实验的顺利进行。

   

    图4:夹心法

    特点

    常用于抗原测定，适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原。优点：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

    竞争法：

    首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。

   

    图5：竞争法

    特点

    常测定小分子抗原：如激素和药物之类，也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。优势：可适用不纯的样本，快速高效。缺点：整体的敏感性和专一性都较差。

    ELISA应用

•     生命科学研究：ELISA试剂盒可以用于检测细胞因子、激素、酶、抗体等分子的含量和活性，用于生理学、免疫学、分子生物学等研究领域。
•     常规临床诊断应用：抗原及其抗体检测,特种蛋白的检测,非肽类激素的检测,血液中药物浓度的检测。
•     食品安全检测：检测食品中的重金属,农药残留,生物毒素等。
•     畜牧养殖中疫病：饲料中农药、霉菌毒素等有毒有害物质的残留以及畜禽产品中药物残留检测，畜禽养殖中疫病诊断。
  

    ELISA样本

   

    利用ELISA进行检测的样本类型包括：血液（血清、血浆）、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等。常见的样本处理方法如下，仅供参考：

    一、血液样本

    1.血清：

    1）将收集于血清分离管的全血样本，在室温放置2小时或2-8℃过夜。（这是一个让血液自然凝固的

    过程，温度越低，凝集越缓慢，可根据需要添加促凝剂。）

    2）1000×g离心20分钟，取上清。

    3）可立即检测，或分装冻存于-20℃或-80℃。

    2.血浆（柠檬酸，EDTA，肝素）：

    1）血浆样本需要抗凝，将全血收集到干净的含抗凝剂的试管中，轻轻混匀。

    2）标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清。

    3）可立即检测，或分装冻存于-20℃或-80℃。

    血清/血浆的区别与选择

    血清是血液凝固后缺少纤维蛋白原的血浆，故血浆中除含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均等同于血清。

    由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血产物。如果检测凝血因子，建议选择血浆样本；

    因血浆中有纤维蛋白原，如果纤维蛋白原对待检测指标有影响，建议选择血清样本；

    大多数情况下二者均可以选择。

    二、组织样本

    组织样本一般制成组织匀浆，处理方法如下：

    1.使用干净的工具解剖目标组织，尽快置于冰上，以防被蛋白酶降解。（暂时不处理的组织，置于圆底微量离心管中，浸入液氮中“速冻”，在-80℃下存储样品备用）

    2.用预冷的PBS缓冲液（0.01M，pH=7.4）洗涤组织去除残留的血液，称重后备用。若组织块较大，需先剪碎。

    3.在冰上用研磨缓冲液（常用PBS缓冲液，但最好使用50mMTris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH7.3。或者中等强度RIPA细胞裂解液，注意RIPA裂解液PH值需为PH7.3，建议不要使用含NP-40，TritonX-100和高浓度DTT的组分，会抑制抗原抗体反应。）研磨组织匀浆（加入研磨缓冲液的体积取决于组织的重量。一般情况下，每1克组织碎片应使用9ml研磨缓冲液。另外建议在研磨缓冲液中加入一些蛋白酶抑制剂，如1mMPMSF）。得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过程中，需冰浴降温；反复冻融法可重复2次）。

    4.将制备好的匀浆液于5000×g离心5分钟，留取上清即可检测。或分装冻存于-20℃或-80℃。

    5.根据实验需要，组织匀浆样本可先定量总蛋白,以便于统计分析数据，一般调整总蛋白浓度至1-3mg/ml。某些组织样本，如肝脏，肾脏，胰腺因含有较高浓度的内源性过氧物酶,在样品浓度较高的情况下会和试剂盒底物反应出现假阳性。

    三、细胞样本

    1.细胞培养上清：

    1）使用96，24，6孔板，（贴壁或悬浮）细胞密度达到60-90%。

    2）使用6-10mm培养皿，T25/T75细胞培养瓶，（贴壁或悬浮）细胞密度达到60-90%。

    3）悬浮细胞：2-8℃，2500rpm离心5min，收集澄清的细胞培养上清。

    4）贴壁细胞：直接收集上清液，2-8℃，2500rpm离心5min，收集澄清的细胞培养上清。

    5）立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。

    2.细胞裂解液:

    悬浮细胞：

    1）2-8℃，2500rpm离心5min，收集细胞。

    2）加入预冷的PBS,轻轻混匀，2-8℃，2500rpm离心5min，收集细胞。

    3）加入0.5-1ml中等强度RIPA细胞裂解液(注意RIPA裂解液PH值需为PH7.3，建议不要使用含NP-40，TritonX-100和高浓度DTT的组分，会抑制抗原抗体反应。若无RIPA裂解液，可使用50mMTris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH7.3)及适量蛋白酶抑制剂（如PMSF，工作浓度1mmol/L）,置于冰上，裂解30min-1h。裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，使蛋白充分裂解,出现黏糊状是DNA，可以使用超声波破碎DNA。（或用超声波3-5mm探头，功率150-300W,冰上超声处理样品，工作1-2s，停止30秒，3~5个循环。）

    4）裂解或超声破碎完成，2-8℃，10000rpm离心10min，上清移入EP管中，立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。

    贴壁细胞：

    1）吸走上清液，加入预冷的PBS洗三次。

    2）加入0.5-1mlRIPA细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂（具体要求同悬浮细胞），用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞。

    3）细胞悬液转入离心管中，置于冰上，裂解30min-1h，或者配合超声波破碎（同悬浮细胞）。

    4）裂解或超声破碎完成，2-8℃，10000rpm离心10min，上清移入EP管中，立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。

    elisa实验前准备工作

   

上海酶联生物实验室

    使用前所有试剂和样本需放置于室温，静置15分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测。

    1.洗涤液：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇混匀，待结晶完全溶解后再配制洗涤液。依据所需用量计算浓缩洗涤液使用量，可将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成工作浓度的洗涤液。未用完的放4°C。

    2.显色剂：按当次试验所需要用量将显色剂A和显色剂B等体积混合，避光；在使用前15分钟准备，现配现用；每孔需100μL。

    3.稀释用缓冲液：依据所需用量计算浓缩稀释剂使用量，可将浓缩稀释剂用蒸馏水或去离子水稀释配置成工作浓度的稀释剂。

    4.SA-HRP：如提供的为浓缩SA-HRP，则需使用稀释用缓冲液（1×）稀释配置成工作浓度的1×SA-HRP,每孔需100μL。检测抗体：将干粉离心至管底，检测抗体的重溶体积请参考瓶身标签，用稀释用缓冲液重悬至相应体积。（未用完的检测抗体溶液可保存于4°C冰箱。）

    5.标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液重溶，重溶体积请参考瓶身标签，按说明书制备标曲所用的稀释方式配置。

    实验操作步骤加样

   

    加一定稀释的待检样品100μL于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

    加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(按照说明书进行稀释)100μL。37℃孵育0.5～1小时，洗涤3次。

    加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μL，37℃10～30分钟。※加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；

    计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。

    注意事项

    1）正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

    2）实验材料的保存比较重要，一般需要注意的点如下：

    ※ELISA试剂盒一般是4℃保存，如果有溶解后的标准品次日需要使用，则需要-20℃，防止降解导至结果不准；

    ※未使用的标准品与未用完的试剂盒一起保存，一般试剂盒拆分后建议一周内使用，由于湿度等影响，长期放置易引起产品的不稳定；

    ※对于洗涤，常规建议机洗，有些较为老款的洗板机由于时间较久，可能加液冲力较大或有固定的洗涤液，可能会导至结果异常，需慎重选择；

    ※ELISA试剂盒正式实验前，建议先进行预实验，避免出现浓度超出检测限导至的结果无法使用的情况；

    ※各家试剂盒可能略有差异，使用前建议详细阅读说明书。

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