IVD技术丨熔解曲线分析在多重核酸检测中的应用

2022-2-8 17:17| 编辑: 归去来兮| 查看: 18739| 评论: 0|来源: IVD技术咖 | 作者：技术小咖

摘要: 在分子诊断技术中，实时荧光PCR依然是应用最为广泛的检测方法，具备快速准确、单管封闭的特点。但对于多重核酸检测，该方法也存在一定限制，特别是在单荧光通道检测中，实时荧光PCR便难以区分多靶标检测结果。为了弥 ...

在分子诊断技术中，实时荧光PCR依然是应用最为广泛的检测方法，具备快速准确、单管封闭的特点。但对于多重核酸检测，该方法也存在一定限制，特别是在单荧光通道检测中，实时荧光PCR便难以区分多靶标检测结果。为了弥补该不足，其中的一种方法便是对扩增后的产物进行分析，而熔解曲线技术便是最为简单方便的分析方法。

一、熔解曲线介绍

1.熔解曲线形成原理

双链DNA具有一个固有的特性——熔解温度（Tm），是指反应体系中的一半双链DNA发生解链时的温度，该温度与双链DNA的长度、碱基组成及其匹配程度有关。

SYBR Green I是熔解曲线分析中较为常见的荧光染料，可非特异的结合至双链DNA小沟中，其在游离状态下，发射出的荧光较弱，一旦嵌入双链DNA中，荧光信号便大大增强，因此可用于双链DNA扩增产物的实时检测。SYBR Green I不与单链DNA结合，但可结合于任何双链DNA，因此无法区分引物二聚体或非特异性扩增产物，熔解曲线分析技术便应运而生。

当PCR扩增完成后，对反应体系进行升温检测，在温度升高过程中，双链DNA逐渐解链，嵌入DNA双链中的染料（SYBR Green I）也随之脱落，荧光信号减弱。当达到某一温度时，双链DNA迅速解链，荧光信号骤降，该温度下有一半的双链DNA解链。随后，温度继续升高，直至双链DNA完全解链，荧光信号减弱至最低。因此，对该过程中的荧光信号进行实时检测，即可获得荧光信号强度随温度变化的原始图谱，再对该荧光信号进行负导数转换，并绘制荧光信号变化与温度的关系图，图中出现的特征峰对应的温度即为Tm值。基于Tm值的差异，便可对同一荧光通道的不同病原体进行区分。

2.高分辨率熔解曲线

虽然熔解曲线可区分不同PCR产物，但对于微小差异的扩增产物（如单碱基突变），通常无法区分。为了提高熔解曲线分析技术的准确度，研究者又开发了高分辨熔解曲线分析技术（high-resolution melting analysis, HRM）。

该技术主要在试剂和仪器两个方面对熔解曲线分析技术进行改进。SYBR Green I作为一种不饱和荧光染料，无法确保全部PCR产物均嵌合上SYBR Green I，因此其检测分辨率受到一定限制。而后续开发的一类饱和荧光染料（如LC Green、LC Green Plus、SYTO 9和Eva Green 等），则有着更强的DNA结合能力，也不会影响PCR扩增，而且在DNA解链过程中不会发生重排，使得熔解曲线具有更高的分辨率。荧光PCR仪的熔解速率也由传统1℃/s精度的荧光监测，提升至0.02℃/s精度的荧光监测，并结合软件分析，可准确地显现熔解曲线间的细微差异，从而实现单碱基突变的检测和区分。

二、多色探针熔解曲线分析技术

1.原理介绍

多色熔解曲线分析技术（Multicolor Melting Curve Analysis, MMCA）基于探针法和熔解曲线分析法，结合多色荧光检测，可同时检测一个反应中的多个靶标。其探针采用双标记、自淬灭的TaqMan探针或分子信标，检测原理为：当TaqMan探针游离于溶液中处于无规则卷曲状态时，或分子信标由于茎部碱基的互补配对形成茎环结构时，探针上标记的荧光基团与淬灭基团相对靠近，因荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)使得荧光信号较弱。而当反应体系中存在靶标序列时，探针与靶标序列互补配对，形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团相对远离，发射出较强的荧光信号。当扩增完成，产物量达到最高峰，荧光信号也最强，此时再对扩增产物进行升温检测，则杂交在产物上的探针与靶标序列逐渐解离，形成无规则卷曲状态，荧光信号逐渐减弱，绘制温度与荧光信号的变化曲线图，即可进行熔解曲线分析。

2.技术解析

MMCA技术是常规探针法实时荧光PCR的拓展，结合熔解曲线，使得单一荧光通道的可检测靶标数增多。再利用实时荧光PCR仪的多色荧光通道，则检测靶标数大大增加。但是，我们也知道探针法荧光PCR检测过程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性会切割探针，不利于熔解曲线的形成。为了降低DNA聚合酶对探针的水解，需调整反应体系中的引物浓度，使得上游引物用量远小于下游引物，形成不对称PCR。这样，与上游引物同向的探针被水解的数量便会减少；同时，下游引物引导扩增，产生了大量可与探针互补的反义链。由此，基于探针法的熔解曲线分析技术便建立起来了。

MMCA技术的探针设计决定了其Tm值，探针与靶标序列的匹配程度，可直接反映在检测的Tm值上，因此对于错配碱基序列，可使用一条探针检测多个匹配程度不同的靶序列，如使用一条探针区分野生型、纯合突变型和杂合突变型。

3.产品应用

厦门致善基于MMCA技术开发了一系列产品，更是在202

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