巢式PCR？多重PCR？

上呼吸道感染检测卡

检测卡反应原理

1、巢式PCR的定义

巢式PCR(nest PCR)是一种变异的PCR，使用2对（而非1对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为它们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。

巢式PCR反应

同常规单次PCR相比，巢式PCR对特定基因片段连续两次放大后，其诊断的敏感性、特异性均大大提高。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少，同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度，这样在第一次PCR时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物，经过若干次循环，待外引物基本消耗尽，无需取出第一次PCR产物，只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这样不仅减少了操作步骤，同时也降低了交叉污染的概率。这种PCR称中途进退式。

2、巢式PCR反应

巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。

3、巢式PCR的实验步骤

第一步：目标DNA模板与蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段（图中未显示可能的多种产物)；

第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。

由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此，第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有因引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

4、巢式PCR的应用

巢式PCR一般应用于动物方面，如病毒、梅毒螺旋体、HIV、肿瘤基因等。

目前，国外β地中海贫血的植入前诊断主要依靠巢式PCR结合突变检测技术。在针对β地中海贫血研究建立的单细胞多重巢式PCR诊断体系中，邓捷等人设计的引物跨越了16种中国人常见β地中海贫血突变类型，结合应用反向点杂交技术，可以同时检测诊断中国人常见的16种β地中海贫血突变类型，淋巴细胞中平均扩增效率为91.3%，等位基因脱扣(allelo drop out，AD0)率为17.0%，卵裂球中扩增效率为90.9%，AD0率为13.3%，与文献报道的大约10%的扩增失败率及5%~20%的AD0率接近。

巢式PCR可以在10^6基因组背景下检测到1个拷贝的病毒基因，不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，但也因此是最容易污染的PCR。

1、多重PCR的定义

一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系中加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

有些疾病相关基因十分庞大，且常多处发生缺失或突变，而这些缺失或突变距离又较远，因而在同一反应中加人多对引物，扩增同一模板的不同区域，以达到共同诊断的目的。

目前，有报道多重PCR可以同时扩增12条区带。同时，通过扩增跨越突变位点的DNA片段和与致病基因连锁的多态性标记物，还具有监测DNA污染和等位基因丢失而导至假阳性和假阴性结果，因为同时导至两种扩增片段丢失的机会很低。

2、多重PCR的应用

多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染，可系统组合的有：

①肝炎病毒的感染。在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲、乙、丙型肝炎病毒重叠，有时可能是甲、乙型肝炎病毒重叠，有时是乙、丙型肝炎病毒重叠；

②肠道致病性细菌的检测。如伤寒、痢疾和霍乱的诊断，这些疾病有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾、霍乱同时存在于一个病人并同时发病；

③性病的检测。如梅毒、淋病及艾滋病的诊断；

④战伤细菌及生物战剂细菌的检测。如破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌等侦检；

⑤需特殊培养的无芽孢厌氧菌的鉴定。如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等。

某些病原微生物、遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在于多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。可系统应用的有：乙型肝炎病毒的分型，乳头瘤病毒的分型，单纯疱疹病毒的分型，杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等。

3、多重PCR的特点

多重PCR的特点有：

①高效性。在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体；

②系统性。多重PCR很适用于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病、无芽孢厌氧菌、战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检；

③经济简便性。多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大地节省时间、节省试剂、节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。