IVD实验对照设计（2）：如何实现阴性对照设计的"逻辑闭环"

1）排除假阳性：识别非特异性信号（如抗体交叉反应、试剂污染等）；

2）验证实验特异性：确认检测系统仅针对目标物质响应；

3）设定基线阈值：为数据解析提供背景参考（如流式电压调节、WB曝光时间）。

1.2阴性对照的常见类型

根据实验需求，阴性对照可分为以下几类：

流式细胞术：FMO对照（Fluorescence Minus One）、补偿对照；

免疫共沉淀（Co-IP）：反向IP对照、竞争性肽段阻断；

高通量测序：接头二聚体对照、文库制备阴性对照。

2.1流式细胞术：从"单点验证"到"多维排除"

1）仅依赖同型对照：同型对照虽能排除部分非特异性结合，但无法解决荧光溢漏问题（如PE通道信号渗入FITC通道）；

2）未匹配生物学阴性对照：例如检测肿瘤标志物时，未使用正常组织作为对照，导至无法区分肿瘤特异性信号。

例如，在检测T细胞亚群（CD3+CD4+CD8−）时，若仅使用同型对照，可能因CD8-APC的荧光溢漏导至CD4-PE假阳性；增加FMO（CD8-APC）对照后，可明确区分真实信号与溢漏信号。

Co-IP的阴性对照需排除抗体非特异性沉淀和珠子吸附干扰，但当前许多研究仍存在以下问题，典型误区包括：

1）仅设置空白珠子对照：无法排除抗体本身的非特异性结合（如抗体重链与样本蛋白的相互作用）；

2）忽略反向IP：仅用蛋白A的抗体拉蛋白B，未验证蛋白B是否能拉蛋白A，导至假阳性互作。

例如：验证蛋白A与蛋白B的相互作用时，若仅用抗蛋白A抗体IP后检测蛋白B，可能因抗体非特异性结合导至假阳性；增加肽段阻断对照后，若信号消失，则可确认结合特异性。

3.1 第一性原理的思考路径

1）实验的目的是什么？（如验证蛋白互作、检测细胞表面标志物）；

2）哪些环节可能引入假阳性？（如抗体交叉反应、荧光溢漏、珠子吸附）；

3）如何通过对照逐一排除这些干扰？（需覆盖试剂、样本、操作全链条）。

1）试剂干扰（抗体、珠子、缓冲液）；

2）样本干扰（复杂基质、内源性物质）；

3）操作干扰（交叉污染、非特异性结合）。

1）试剂问题 → 同型对照、空白珠子对照；

2）样本问题 → 阴性样本对照、FMO对照；

3）操作问题 → 无模板对照（NTC）、环境对照。

1）若阴性对照出现阳性信号：需定位问题环节并优化实验条件；

2）若阴性对照为阴性：实验结果方可归因于目标物质。