一代测序在产前诊断中的应用

提到一代测序（Sanger测序），就绕不开它的缔造者——英国科学家Frederick Sanger。1977年，他首次完整解析了噬菌体ΦX174的基因组序列，全长5375个碱基，这是人类历史上第一个被完整破译的DNA基因组。这一壮举不仅让人们第一次看清了基因组的“全貌”，也让Sanger在1980年第二次捧起诺贝尔化学奖，成为少数两获诺奖的科学家之一。

到了20世纪80年代，ABI公司在Sanger方法的基础上推出了BigDye试剂，结合毛细管电泳，实现了测序的自动化和商业化。可以说，Sanger测序的出现，直接推动了人类基因组计划的启动和完成，被誉为分子遗传学的里程碑技术。即便如今二代测序（NGS）、三代测序（TGS）迅速崛起，Sanger测序依然因其高准确性（可达 99.999%）而被称为“金标准”。

图1：弗雷德里克·桑格(左）；BigDye试剂和商业化测序仪（右）

Sanger测序的原理是模拟体外的DNA复制。在正常的复制反应中，DNA聚合酶会根据模板链，将脱氧核苷酸（dNTP）逐一接到新链的3’端。每个dNTP都带有一个3’羟基（–OH），这是形成磷酸二酯键使DNA链继续延伸所必需的。但在Sanger测序中，反应体系除了含有dNTP，还会加入双脱氧核苷酸（ddNTP）。ddNTP缺少3’羟基，一旦被掺入，无法形成磷酸二酯键使DNA链就无法继续延长，从而终止复制。由于掺入位置是随机的，最终会生成一系列不同长度的DNA片段，每个片段的末端都停在某个特定的碱基上。这四种ddNTP分别带有不同颜色的荧光标记。片段经毛细管电泳分离后，会依次通过检测窗口。激光激发荧光，仪器记录下颜色和片段长度。这样就能依次读出A、T、C、G的排列顺序，得到完整的DNA序列。换句话说，Sanger测序正是通过控制DNA链的“随机终止”，再结合电泳分离与荧光检测，将看不见的分子反应转化为可读的序列信息，从而实现对DNA的精确测定。

   图2：一代测序的原理

下表是与二代测序的比较：

虽然相比NGS，Sanger测序的通量低、成本高、实验周期长，但凭借其高准确度 (>99.999%)和较长读长 (700–850 bp)的优势，Sanger测序在产前诊断中仍然发挥着重要作用，主要体现在以下几个方面：

1. 单基因病检测

Sanger测序可针对已知致病基因进行精确检测。例如：地中海贫血（检测 HBB 或 HBA 基因的特定突变，判断胎儿是否携带致病等位基因），囊性纤维化（检测 CFTR 基因的常见致病突变，辅助产前筛查）。杜氏肌营养不良（检测 DMD 基因的点突变或小缺失）。

在家系中如果存在已明确的致病突变，Sanger测序可以快速、准确地判断胎儿是否携带该突变，为产前决策提供可靠依据。

2. 二代测序结果验证

NGS在高通量检测中虽然能够覆盖全外显子或全基因组，但仍可能出现假阳性或假阴性结果。Sanger测序常用于验证关键突变，确保检测结果的可靠性。例如：对 NGS 检出的疑似致病点突变进行单独测序确认。验证复杂区域或高 GC 含量序列中的变异，避免因测序偏差产生误判。

3. 家系验证与遗传咨询

在遗传病家系研究中，Sanger测序能够帮助明确突变来源：判断变异是否来自父母一方或为新发突变。辅助风险评估：为孕妇及其家庭提供科学的遗传咨询依据。支持家系追踪：在多胎或家族成员检测中，帮助确认同一突变在不同个体中的遗传情况。

4. 辅助科研与质量控制

另外Sanger测序还用于实验质量控制和方法验证：捕获探针验证（确认用于二代测序的捕获探针是否能有效捕获目标序列)。质粒序列检测：确认实验中使用的质粒或克隆片段序列完整性。结果复核（对临床检测中发现的关键变异进行复核，保证诊断结论的准确性）。

总结