荧光免疫层析检测系统的研发策略（以D-二聚体为例）

莺歌燕舞

免疫层析技术是迄今为止对目标物质进行现场检测最成功的分析平台之一，具有快速、简便、易读、现场适用性好、所需体积小、生产成本相对较低等一系列优点。
免疫层析技术是华美科赛格IVD原料验证的核心技术之一。它的基本检测原理是将抗原或者抗体标记到胶体金或荧光微球上，同时将抗原或者抗体固定到硝酸纤维素膜上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后, 通过毛细作用向前移动, 溶解标记物垫上的已经标记过的抗原或抗体后相互反应, 再移动至固定了抗原或抗体的区域时发生特异性结合而被截留, 聚集在检测带上，通过胶体金或荧光微球的信号检测实现特异性的免疫分析。



荧光免疫层析中微球标记抗体对最终试剂性能有着重要的影响，今天小编就为大家分享下微球标记方面的内容，希望对各位老师的研发工作有所帮助。
微球的标记流程
1. 微球选择
目前市面上微球大小一般为100-400nm，其中微球的粒径越小，线性越长，粒径越大，灵敏度越高。当然不同厂家粒径相近也存在灵敏度不同，可能跟每家的表面羧基含量不同或者工艺不同有关。
2. 抗体投料量
研发人员都是希望尽可能减少抗体的投入量以节省成本。一般来说粒径在150nm以下的微球，初始抗体投入量可以是200ug/mg，粒径在150nm以上的微球初始投入100ug/mg，通过梯度验证，确定最终抗体投入量。
3. 一步法or两步法
一步法中，微球活化后加入蛋白时未移除多余的EDC。优点是反应步骤和时间缩短，缺点是可能不是蛋白质的最佳偶联条件，从而导致偶联效率变低；由于多余EDC的存在，有些蛋白对此敏感，容易引起失活或者标记失败。
两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。排除其对抗体活性的可能影响，也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面、加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。缺点是反应步骤繁多和时间比较长。
4. 微球标记
微球标记包含4大步骤，分别为：活化-偶联-封闭-复溶保存，对于活化前后是否对微球清洗，各位老师可以根据自己项目进行选择。标记环节中活化、偶联和封闭是免疫标记的重要环节。以下我们会介绍微球在免疫标记中活化、偶联和封闭实验过程中的一些注意事项。
①活化
微球常用的活化剂有EDC和NHS。EDC是极易溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中，用作羧基的活化试剂，使用时的PH范围一般为4.0-6.0，常和NHS连用，以提高偶联效率。在活化微球上的羧基时，微球跟活化剂的质量比，EDC跟NHS的质量比都有一个合适的比例，过少会导致活化不充分，偶联效率低，最终降低灵敏度；过高会导致微球聚集发生形态改变，也会降低偶联效率。
EDC的活化浓度与微球的表面羧基含量相关，应根据微球厂商提供的表面羧基含量计算EDC和NHS的合适反应浓度，一般按照微球表面羧基含量的1.2~1.5倍EDC用量即可。不足量的EDC易导致羧基不能充分活化，反之，过量的EDC和NHS较难在后续步骤中清洗干净，进而可能影响偶联反应。
②偶联
在同样的体系下，用微球标记不同的抗体，有些抗体会出现聚沉，导致该现象发生的主要原因是不同抗体的等电点存在差异。当体系的PH不合适该抗体会导致电荷分布不均匀，从而产生不同程度的聚沉现象，因此偶联不同的抗体时，可以尝试对体系的PH做出调整，从而找到该抗体适合的PH。当然标记浓度、偶联时间、温度对标记效果也有着很大的影响。
③封闭
微球与抗体通过共价键结合，然而微球上未结合抗体的表面仍然有吸附其他蛋白的能力，会干扰后续特异性反应。牛血清白蛋白普遍被认为是非常好的封闭剂，也可用脱脂奶粉、Casein、乙醇胺、明胶等替代。
案例分享------D-二聚体
D-二聚体(D- Dimer)是纤溶酶作用于交联蛋白的特异性分子标志物。它含有两个相同的亚基，每个亚基都由α、β和γ三个多肽链组成，就是通常所说的“D-二聚体”,D-二聚体检测在排除深静脉血栓栓塞症(DVT)和肺栓塞(PE),有着广泛的应用。另外D-二聚体出现在继发性纤溶中，对其他血栓形成性疾病如弥漫性血管内凝血(DIC)、脑血管疾病、肝脏疾病及恶性肿瘤等疾病均有重要的诊断价值。同时D-二聚体检测还可用于溶栓药物的治疗监测指标。
华美科赛格D-二聚体（D- Dimer）单抗产品在荧光免疫层析平台测评，将本公司的自产抗体制成试剂检测34例希森美康赋值样本（浓度范围：0.16-31.15 ug/ml），两者相关性高达0.98，说明本公司自产单抗适用于荧光层析平台。
产品信息
宿主动物：Balb/c小鼠
融合细胞系：Sp2/0
抗原：D-二聚体
纯度：经SDS-PAGE检测，纯度>90%
提纯方法：蛋白A亲和层析
物理状态：溶于PBS，0.22 μm过滤，含微量叠氮钠
货号：CSB-DA220HmN③ - CSB-DA220HmN④
比对试剂：希森美康
相关性：＞0.98
定标曲线



相关性——与希森美康相比，相关系数R2 = 0.9838





产品信息



华美·科赛格不仅可以为工业客户提供关键生物原材料，并且能够根据客户需求依托公司深厚的技术积累和研发创新实力，为客户提供个性化定制开发和针对性的系统解决方案，以客户为中心，全力满足客户需求。



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