蛋白纯化--色谱层析

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三种色谱层析

一、凝胶过滤色谱(Gel filtration chromatography，GFC)又称尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)是一种常用的蛋白质纯化分离技术，可以根据分子的流体动力学体积或大小差异来进行分离。
1.原理
惰性凝胶介质是由物理化学性质稳定的球形微珠组成的多孔基质，同粒径分布的分析物混合物进入色谱柱时，大于孔径的分子无法进入微珠，随后，他们直接通过微珠之间的空隙被最先洗脱下来。而小于凝胶孔径的分子会扩散进入微孔中，他们的洗脱时间由分子量决定(图1)。



凝胶色谱层析

凝胶过滤区别于其他两种主要色谱技术（即离子交换和亲和色谱）的显着特征之一是蛋白质分子与溶剂（即流动相）之间没有直接相互作用。
优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等特点。
适用于:
1.分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质。
2.测定蛋白质的分子量。
3.分子大小相差25％的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
4.样品的浓缩和脱盐去热源和脱色等。
缺点：分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离；料液处理量小，并且样品粘度不宜太高分离操作较慢。
除了根据蛋白分子量来分离蛋白，GFC另一个重要的应用是脱盐。由于GFC通常用于蛋白质纯化的最后一步，因此可以将蛋白洗脱至所需缓冲液中。样品中的盐组分与大分子存在巨大的分子量差异，可以很容易去除掉。
二、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pH 等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原子序数越高，结合力越大。
如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为：
Li+＜Na+＜ K+＜ Rb+＜ Cs+ ; Na+＜ Ca2+＜ Al3+＜ Ti4+
蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH 有较大关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH 条件下，若溶液PH>蛋白的PI，蛋白带负电，不能与阳离子交换剂结合；若溶液PH<蛋白的PI，蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般pI 越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。
先来段绕口令: pH高于蛋白等电点，蛋白带负电，用阴离子交换层析，阴离子交换剂带正电。
三、亲和层析是一种通过分子间的特异性识别和相互作用来分离纯化物质的层析方法。如酶与底物、抗原和抗体之间专一的相互作用等。将其一作为配基固定在填料上，就可以从初始样品中吸附相应的生物分子，然后通过合适的洗脱将其解离达到纯化的目的。配基能与待纯化分子之间的相互作用实现纯化的目的主要是静电相互作用、氢键、配位键、疏水相互作用和弱共价键等综合作用的结果。
亲和作用体系的特异性可以分为高特异性和群特异性。高特异性是指配体与目标分子之间的相互作用呈现一对一关系，例如，抗原与抗体的结合、酶与底物的结合等。群特异性是指配体能和一类分子进行结合，例如，免疫球蛋白与Protein A或ProtienG的结合、酶与多种配体金属离子的结合等。亲和层析具有高选择性、高分辨率、高结合载量的优点，经常可以一步纯化达到＞90%的纯度，能够完成一般方法很难完成的分离。
在亲和层析中，影响亲和作用的因素主要有：（1）离子强度：亲和作用的强度通常随着离子强度的升高而降低；（2）pH：过酸或过碱的条件通常削弱亲和作用；（3）抑制氢键形成的物质：如脲和盐酸胍的存在会减弱亲和力作用；（4）螯合剂：这些化合物会削弱配位键，使亲和作用减弱或消失。
亲和层析分类详解
1. 镍亲和层析
过渡金属通过与电子供体配基上能与金属离子相互作用的羧基或氨基的电负性元素（O,N）形成较稳定的金属螯合物。在镍柱亲和层析中，一个Ni2+有六个配位位点，被含有3,4或5个电子供体基团的螯合物固定在吸附剂上，而剩下未被占据的位点暴露于溶液中，能与组氨酸，半胱氨酸和色氨酸的侧链或组氨酸标签的蛋白特异性结合。
金属离子亲和层析中常见的螯合配基有IDA（亚氨基二乙酸）、NTA（次氮基三乙酸）和TED（羧甲基乙二胺）等，分别拥有3,4,5个配位位点与Ni2+结合，而空余的能与组氨酸标签结合的位点还剩3,2,1个。所以IDA与His标签蛋白结合的能力相对最强，特异性较弱，而TED则相反。在实际应用中通常选择载量和特异性适中的NTA类型。
镍柱的洗脱通常采用竞争性洗脱，先用低浓度（10-50 mM）的咪唑将杂蛋白和结合不牢的蛋白洗掉，再用合适浓度的咪唑(200-500mM)将目的蛋白洗脱。洗脱的先后顺序与蛋白的结合能力相关。
镍柱进行蛋白纯化时注意事项：(1)避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：甘氨酸，精氨酸等；(2)各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA等；(3)各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价Ni被还原；(4) 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；(5)在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；(6)缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）；(7)应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；(8)缓冲液里NaCl的浓度应在100mM到2M之间；(9)可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M）,尿素（最高可8M）；(10)可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP-40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。
2.GST-tag亲和层析
   谷胱甘肽-S-转移酶（GST）是生物体内的一类重要的代谢酶，参与外源和内源有毒物质的代谢。GST通过催化还原型的谷胱甘肽（GSH）和有毒物质偶联反应，使有毒化合物的水溶性增加从而更容易排出体外，最终达到解毒的作用。GST亲和层析是利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价结合，通过GSH竞争洗脱的原理来进行蛋白纯化。GST亲和层析纯化蛋白的条件温和，可以保证蛋白的活性。
GST柱进行蛋白纯化时注意事项：(1)在细胞裂解时，加入终浓度1-10 mM DTT可以显著提高GST融合蛋白的结合效率，在Binding Buffer和Elution Buffer中加入1-10 mM DTT，可以提高蛋白纯度，但是会导致其产率降低；(2)超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性，导致蛋白不能与介质结合；(3)在pH值低于6.5或高于8.0结合效率会降低，使用前需用pH6.5-8.0的Buffer如PBS进行平衡；(4) Elution Buffer的pH值调至pH 8-9可以提高洗脱效率而不需要增加glutathione的浓度；(5)增加Elution Buffer的离子强度。加入0.1–0.2 MNaCl能提高洗脱效率；(6)Elution Buffer中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍GST融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入0.1%TritonX-100 or 2% N-octylglucoside可以显著增加洗脱效率。
3. MBP-tag亲和层析
麦芽糖结合蛋白（MBP）有 42.5KD 大小，不含 Cys，作为融合蛋白的标签，通常放在 N 端在大肠杆菌中进行表达。MBP 能促进融合蛋白的可溶性表达，尤其对于难表达的真核细胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表达能力，MBP 融合蛋白的纯化在生理条件下进行，使用麦芽糖进行温和洗脱。保护了MBP 标签蛋白的活性。标签在纯化后期需要用酶切去除，常用的内切酶是 Factor Xa，麦芽糖酶和肠激酶。
4. Protein A亲和层析
ProteinA是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。天然ProteinA有5个IgG结合域和许多其它的未知功能域。重组ProteinA包含5个高IgG结合域，并去除了其它非主要结合域以降低非特异性结合。 Protein A亲和层析介质已经广泛用于从生物流体或细胞培液中分离纯化各种类型的IgG或者IgG片段。实验已经证明，Protein A和IgG的相互作用仅涉及Fc区域，而不影响Fab片段和抗原的结合。
ProteinA进行蛋白纯化时注意事项：(1)介质的选择A,G or 其他，其结合能力的选择；(2)上样流速尽量小，让Protein A和抗体有充分的结合时间；(3)在低pH值洗脱后，快速中和；(4)长时间保存样品加入0.02-0.05％叠氮钠；(5)加入10%甘油，可有效防止疏水作用引起的聚集；(6)抗体纯度不够，杂蛋白含量高，易引起蛋白的沉淀。
5. FLAG-tag 亲和层析
  FLAG标签是由8个氨基酸（DYKDDDDK）组成的一个短肽，分子量很小，因而不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域，也不会改变融合蛋白的功能、分泌或运输。该标签具有天然的亲水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗体检测；同时含有一个肠激酶切割位点（DDDK），可以利用肠激酶切除标签。FLAG标签有2个特异性的单克隆抗体，分别为M1单抗、M2单抗。FLAG短肽合成成本较高，不适用于大规模纯化，且需要额外步骤除去结合在层析介质上的短肽。
6. Strep-tag亲和层析
用于蛋白在原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统等的表达与纯化中。通过对链霉亲和素特定氨基酸的定向突变，获得与Strep-tagⅡ具有更高亲和力的亲和介质Strep-tactin，在Strep-tag融合蛋白的亲和纯化中表现出良好的纯化效果，且蛋白质产量较高，所需成本适中。  Strep-tagⅡ系统的纯化条件比较宽泛，在普通缓冲液下就可与strep-Tactin层析介质结合，使用2.5mmol/L的脱硫生物素就可将Strep-tagⅡ融合蛋白洗脱下来，螯合剂、去污剂、还原剂及高达1mol/L的盐均可加入到缓冲液中。此外，Strep-tagⅡ在纯化过程中不依赖金属离子，十分适合含金属离子蛋白质的纯化。
7.肝素亲和层析
肝素是一种含有硫酸酯的酸性多糖。根据肝素的生理作用，可以与很多活性调节小分子结合（其生理作用就是和很多活性调节分子结合抑制其作用），故其能和很多血浆蛋白、生长因子、限制内切酶、凝血酶、凝血因子、脂蛋白和干扰素结合。同时肝素的聚阴离子特性，使其还具离子交换的作用，可用于纯化多种核酸结合蛋白。

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