技术| 分子诊断中所使用的探针之一

Rose

核酸探针已被应用于分子诊断中，以确定临床样本（例如，纯化的、原位的细胞和组织，或在固相中）和扩增后（主要在常规PCR中）的互补靶点。在80年代，Southern blotting法被用作PCR后的一个步骤，用互补探针确认扩增物的序列。

实时PCR（qPCR）的引入是分子诊断领域的一场革命。在扩增过程中，通过特定的探针识别扩增物，逐渐成为诊断中大量应用的金标准。探针不仅能确认扩增物的身份，而且还能进行定量分析。此外，特殊探针可用于分析扩增物的熔点。

1、用于实时PCR的探针

1.1、水解探针（「淬火」）

水解探针优先设计在离退火引物3′端3-10个碱基的位置。在探针的5'端，一个荧光色素被连接到C、A或T（由于固有的猝灭特性，从来没有连接到G），作为标签（大多数是FITC的衍生物）。此外，探针的3'端连接有一个猝灭剂。空间剂允许猝灭剂和荧光色素相互靠近，这是由它们的物理化学特性所决定的。它们的分子轨道可以相互作用，并发生猝灭（见图1）。


图1 | 荧光的猝灭
a 在猝灭过程中，受激电子的能量在回到其地相时不会透光，而是转移到另一个荧光体上。当猝灭剂（Q）和受体/荧光剂（F）在其附近（0.1纳米）时，猝灭是最有效的，这取决于F/Q的组合以及猝灭剂吸收和报告基团/荧光剂的发射之间的高度光谱重叠。
b 在大多数形式的猝灭中，主要是发生所谓的FRET猝灭。由于几种弱的非共价相互作用，F和Q会在对方附近出现，也称为碰撞猝灭。当两者处于正确的方向和相互之间的距离时就会发生猝灭。F和Q之间的强疏水芳香基团在其他F和Q的组合中出现，如支持信标结构（也见图4）。此外，这两个分子之间的静态耦合和变化的吸收光谱也会发生，这被称为：静态猝灭（这种相互作用对温度和溶剂更敏感）。在实践中，这两种形式的组合经常出现。作为比较，两个后续分子之间的距离是0.34纳米。10个核苷酸之间的距离正好是34埃（dsDNA的螺旋结构中的一个扭曲）。

自由的、未结合的探针分子不显示荧光（图2）。水解探针（Tm值比引物高约10℃，最好是富含GC，但与序列的其他部分相协调）与变性靶点杂交的亲和力比引物高（也更快）。这样，探针在引物开始延伸之前就被结合了。




图2 | 用水解探针猝灭
一旦带有分离核苷酸的荧光标签在自由溶液中释放，就会开始发出荧光。猝灭剂也处于隔离状态，但与荧光色素的距离太大，无法猝灭荧光
a 5′-氟色素（F）、MGB（三肽）、猝灭剂（Q）和间隔物的分子组织都在寡聚物的3′端。图2b中概述了连接体。
b 连接在连接体上的荧光色素（F）的分子组织，通过在寡核苷酸的5′端加入胞嘧啶-dUTP。
c 实时PCR中5′-核酸酶活性的原理。靶点变性后，引物和水解探针都会与其中一条DNA链杂交。探针的设计方式是使其比引物更快速有效地杂交。探针必须对扩增物有很高的特异性。探针的位置在靶点的5′端附近。水解探针在溶液中，由于附着在探针上的非荧光猝灭剂（Q）的猝灭作用，不会自动发亮。一旦寡核苷酸与靶点序列完全退火，DNA的合成就从引物（和探针）的3′端开始。当酶遇到水解探针时，聚合酶的5′-3′-外切酶域将变得活跃，并逐个碱基地去除探针。在这个过程中，DNA的合成继续进行。

在DNA合成过程中，DNA聚合酶到达杂交的探针。当遇到探针-靶点杂交体的双链结构时，酶会逐步水解探针，水解3′-5′-糖-磷酸盐共价键。

这样，一个又一个的核苷酸被5′-3′-核酸酶活性释放成可溶性的核苷酸单磷酸酯。第一个被水解的核苷酸是5′-末端的氟铬单核苷酸复合物。一旦后者被释放到溶液中，就会失去与猝灭剂的接触，氟色素就会重新获得其荧光特性（见图1）。当DNA聚合酶水解第一个核苷酸时，探针的Tm值就会大大降低，以至于当它等于Ta时就会自发解离。水解探针的一种特殊形式是短MGB探针（见图3a）。


图3 | 小沟结合（MGB）
a MGB是一种二氢环吡咯三肽，对DNA分子的小沟有特殊的亲和力。它增强了引物或探针的杂交能力。这样，只使用了普通数量的核苷酸的一半。
b中概述了传统探针和MGB探针的杂交和随后的融化过程。靶点的大小是27bp，5′端第5位有错配（绿色野生型，蓝色T/C错配）。很明显，与传统探针相比，短的MGB探针具有更高的区分突变异和野生型的能力。

1.2、分子信标

分子信标是一个探针，它被组织成一个茎环结构的发夹。猝灭剂和荧光色素与探针之间有一个间隔，分别位于寡核苷酸的3′和5′端部，其相互作用方式与上述水解探针相同（图4）。


图4 | 分子信标
分子信标的主要结构和示意图显示了荧光剂（F：EDANS）和猝灭剂（Q：DABCYL）。BHQ和Cy3的结构式。
a 分子信标的例子。分子的3′和5′侧的垂直线表示互补发夹区。
b 经典的分子信标。间隔物在寡核苷酸的5′或3′端一侧耦合，另一侧是荧光染料（F）或猝灭剂（Q）。间隔物由一定长度的碳水化合物组成，以获得彼此之间的紧密接触，达到最佳的猝灭效果。
c 分子信标的示意性概述。用于靶点杂交的互补碱基形成一个环形结构（发夹）。
d 带有额外核苷酸间隔物的荧光色素的位置概述，以改变FAM或TAMRA与BHQ猝灭剂的位置。

靶点特异性部分位于环路，而5-7个非特异性的、处于高Tm的双链构象的互补性（特别是G/C）碱基，形成茎。3′端不能有「G」，环的Tm必须高于Ta 7-10℃。一旦设计出一个环，就可以填入特定的、独特的探针序列的变异。在非过饱和条件下，环路是稳定的，信标不会发出荧光。只有在PCR变性步骤中，环才会解离成一个开放的线圈结构。考虑到所有的杂交都是动态过程，信标与扩增物的杂交发生在冷却到Ta的过程中，并且由于其较高的Tm而先于引物的杂交发生。只有信标的特定部分会与靶点序列结合。

因此，它的5′端和3′端带有猝灭剂和荧光色素，将被物理分离，猝灭将被停止，荧光可以被检测到。所有未杂交的信标在这期间将重新获得茎环结构。因此，必须在退火阶段结束时测量荧光，3步循环方案是必须的。当聚合酶在延伸阶段到达杂交信标时，它将解离。

目前还不完全清楚信标是通过何种机制解离的。然而，它必须保持完整，因为在qPCR过程中，表明游离的氟色素的背景荧光不会增加。据推测，当温度上升到72℃，信标与靶点模板解离时，热力学特性会使信标处于原来的环状结构。

1.3、「双」探针（增强版）

需要两个在相邻的3′和5′端核苷酸上用供体和受体的荧光色素标记的探针。这些探针将在扩增的靶点上「头对头」杂交。供体和受体相互靠近，从而产生荧光（FRET：「福斯特共振能量转移」）（见图5a）。


图5 | 傅氏共振能量转移（FRET）
两个氟色体和激发电子之间的能量转移参与了FRET。 a 首先，一个供体（D）氟色体被激发。然而，第二个氟色素，允许FRET，阻止受激电子正常返回到与光的发射有关的基态。相反，供体（D）的激发电子无辐射地返回到基态，而它的高能量含量则被转移到第二个受体氟色素上，其中的电子反过来成为激发电子。两个荧光体的特定组合导致荧光的转移或信号的猝灭。
b, c, d 显示了FRET在双探针（b）、分子信标（c）和水解探针（d）的应用。
注：受体荧光剂（A）的荧光。供体（D）将其辐射能量转移到受体（A）上。受体会变成荧光（A），但只有当带有供体或受体的两个探针串联杂交时才会这样做。供体（F）将其辐射能量转移到受体（Q）上。猝灭体Q吸收了激发能量，一个电子将被激发。这个电子也会返回到它的基态，而不发射光，只要淬体（Q）和荧光剂（F）保持在彼此的附近，就不会观察到荧光。一旦F和Q发生物理分离，能量转移就不再可能，F将发出荧光。

这种技术也被称为「双杂交」（图6）。双重杂交经常用于高分辨率的熔点分析。


图6 | 双探针杂交（特定化学反应）
用引物和头对尾的探针杂交的扩增物示意图（锚式杂交）。来源 不可追溯的来源（重新绘制）

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