IF, ICC, IHC，傻傻分不清楚？一文弄懂三大免疫定位技术

生物科研实验室

一、有何区别？
免疫荧光（IF）：利用荧光标记的二抗，在显微镜下通过激发光显示目标蛋白的位置，核心是“荧光信号”。适合活细胞、固定细胞或冰冻切片，能实现多色标记（如红、绿、蓝通道叠加），但需避光操作，信号容易淬灭。 免疫细胞化学（ICC）：特指对体外培养的单个细胞进行蛋白定位，样本通常是细胞爬片或悬浮细胞涂片。常用显色法（如DAB显色）或荧光法，重点观察蛋白在细胞质、细胞核或细胞膜的具体分布。 免疫组织化学（IHC）：针对完整的组织切片（如石蜡包埋或冰冻切片），通过显色反应定位组织内蛋白表达。优势是保留组织结构信息，能直观比较不同区域（如肿瘤与正常组织）的蛋白差异，但多色标记难度较高。 一句话总结： •想看细胞内的精细定位？选ICC！ •要分析组织中的蛋白分布？用IHC！ •追求炫酷多色成像？试试IF！ 二、操作流程 1. 样本制备 •IF：细胞或组织需尽快用4%多聚甲醛固定（15-20分钟），防止蛋白降解。若做活细胞成像，需用温和固定剂（如甲醇/丙酮=1:1）。 •ICC：细胞爬片固定后需透化处理（0.1% Triton X-100，10分钟），让抗体进入细胞。注意：透化时间过长会破坏细胞膜结构！ •IHC：石蜡切片需经历脱蜡、水化、抗原修复（推荐高压热修复：121℃、2分钟，pH6.0柠檬酸钠缓冲液），这是恢复甲醛固定导至抗原表位封闭的关键步骤！ 2. 抗体孵育 •IF/ICC：一抗孵育通常4℃过夜（稀释浓度1:100-1:500），二抗避光室温1小时（1:1000）。若背景高，可增加封闭时间（5% BSA封闭1小时）或加入Tween-20（0.1% PBST洗涤）。 •IHC：一抗孵育多采用室温1小时（浓度1:50-1:200），显色法二抗常用HRP标记（DAB显色需显微镜下实时监控，显色时间通常30秒-2分钟，过久会背景发黑！）。 3. 信号检测 •IF：荧光显微镜下观察，激发光波长需匹配荧光染料（如FITC用488nm，Cy3用552nm）。封片建议用抗淬灭剂（如DAPI封片液），-20℃避光保存。 •ICC/IHC显色法：普通光学显微镜下观察，DAB显色后需苏木素复染细胞核，脱水封片后可长期保存。 三、常见问题及解决方法 问题1：背景太高，一片“雾蒙蒙” •可能原因：封闭不充分、抗体浓度过高、洗涤不彻底。 •解决：增加封闭剂浓度（10%山羊血清），一抗4℃孵育改为室温1小时（降低非特异结合），每步洗涤3次×5分钟（震荡摇床更佳）。 问题2：目标信号弱甚至无信号 •可能原因：抗原修复失败、一抗失效、曝光时间不足。 •解决：更换抗原修复液（如EDTA pH8.0），一抗现用现稀释（避免反复冻融），IF可延长二抗孵育时间至2小时。 问题3：细胞结构破碎或组织脱落 •可能原因：透化过度、切片脱蜡不彻底、载玻片未包被多聚赖氨酸。 •解决：细胞透化缩短至5分钟，石蜡切片脱蜡后梯度酒精水化（100%→95%→80%→70%），载玻片提前用APES处理增强附着力。 四、如何选择？ •目标蛋白表达量极低？选IF荧光法——荧光信号可通过延长曝光时间增强灵敏度。 •需要定量分析？选IHC显色法——利用Image J分析DAB显色区域的积分光密度（IOD）。 •观察动态过程？选活细胞IF——搭配荧光蛋白标记，实时追踪蛋白迁移（但需共聚焦显微镜）。 •临床病理诊断？选IHC——结果直观，兼容HE染色对比，适合标准化报告。 五、三大技术的联合应用 •IF+IHC：在组织切片中同时标记两种蛋白（如用FITC标记CD31显示血管，Cy3标记Ki67显示增殖细胞），需严格避免光谱交叉。 •ICC+IF：细胞爬片上结合荧光标记与DAPI核染色，精准分析蛋白亚定位（如核内转录因子）。 •多重染色：使用不同种属来源的一抗（如兔源抗A蛋白+小鼠源抗B蛋白），搭配对应二抗实现多靶标共定位。