【维真生物_CRISPR/Cas9】基因编辑技术原理是什么？

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【维真生物_CRISPR/Cas9】基因编辑技术原理是什么？
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一、CRISPR-Cas技术是什么？

CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi) 的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能， CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。
CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。
二、CRISPR-Cas9技术原理

CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列（repeat）与长度相似的间隔序列（spacer）间隔排列组成。Cas基因是一类基因家族，编码的蛋白质具有与核酸结合的功能以及与核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合的活性。根据Cas 基因的不同，将CRISPR-Cas9系统分为Ⅰ－Ⅲ 3种类型。在Ⅰ型 与Ⅲ型CRISPR-Cas9系统中，pre-crRNA 初级转录本被CRISPR相关RNA 酶切割成重复序列，释放小的成熟crRNA。成熟crRNA再与相关蛋白质结合形成RNA-蛋白质复合体指导内切核酸酶对外源DNA 序列的识别与降解。Ⅱ型CRISPR-Cas9系统是目前最常用于人工基因组编辑的CRISPR-Cas9系统。根据Cas蛋白的类型不同分为3个亚类：Ⅱ-Ａ型含有Cas1、Cas2、Cas9 和Csn2蛋白质；Ⅱ-Ｂ型含有Cas1、Cas2、Cas4 和Csx12 样Cas9 4种蛋白质；Ⅱ-Ｃ型则有Cas1、Cas2 及Cas9３种蛋白质。其中，Ⅱ 型CRISPR-Cas9 系统最早在改造后用于小鼠和灵长类基因组编辑，是目前研究最为充分的系统。它只需要单独的Cas9蛋白即可在gRNA（guide RNA）的引导下完成对DNA的定点切割。Cas9 蛋白行使功能需CRISPR转录而来的crRNA 与反式激活的及与CRISPR重复区互补的tracrRNA（trans-activiting crRNA，tracrRNA）形成的复合物参与。
为了操作简便，研究者将crRNA和tracrRNA 融合进同一条单链中，设计出单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）。在sgRNA的指导下，Cas9定位于特定DNA序列上，进行DNA双链切割，实现基因组的定向编辑。对靶序列有效的切割还需靶序列相邻的原型间隔序列毗邻基序，即PAM（protospacer-associated motif）的参与。PAM提供两个冗余的检查点，确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理为将tracrRNA：crRNA设计为sgRNA，sgRNA包含位于５′端的靶DNA的互补序列，以及位于３′端的tracrRNA：crRNA的类似序列，crRNA 或sgRNA包含一个20nt指导序列可以直接匹配的靶位点，利用靶DNA的互补序列来定位需编辑的位点，利用tracrRNA：crRNA的类似序列与Cas9结合，实现目标基因定向基因组改造。



图1. CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理

三、CRISPR-Cas9应用



四、CRISPR-Cas9技术优势

1. 效率高：可精确编辑基因组，编辑效率高；
2. 周期短：构建和使用极为方便，极大降低了实验难度，缩短实验周期；
3. 广谱性：无基因、细胞及物种限制；
4. 多重编辑能力：可实现多个靶位点同时进行基因打靶；
5. 功能丰富：可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因.
五、CRISPR-Cas9基因编辑服务步骤



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文献来源：Nature Genetics丨重塑作物育种：利用克隆配子设计多倍体基因组

研究背景

杂交作物凭借杂种优势在现代育种中凸显其价值，尤其多倍体植物能进一步放大优势。上世纪30年代美国杂交玉米的商业化，传统的杂交技术推动了作物的显著进步。特别地，四倍体玉米中的多倍体渐进式杂种优势（APH）展现了巨大潜力。


然而，由于减数分裂过程中同源染色体上等位基因的重组交换，F1代杂交种的杂种基因型在下一代无法固定，这导致了优良的杂种优势在后代中的分离。因此，如何稳定和利用杂种优势成为了种业发展的关键。


2024年5月，Charles J. Underwood教授研究团队在国际学术期刊Nature Genetics在线发表了题为Harnessing clonal gametes in hybrid crops to engineer polyploid genomes的研究论文。首次在双子叶植物中创建了二倍体番茄不同遗传背景中有丝分裂替代减数分裂Mitosis instead of meiosis (MiMe)体系，并通过杂交不同MiMe突变体，成功创制了拥有四套无重组的、完整祖父母基因组的四倍体番茄植物。


构建减数分裂转有丝分裂”（MiMe）系统


选择目标基因：选择参与减数分裂过程的关键基因，例如SPO11、REC8和TAM等，作为基因编辑的目标。
设计sgRNA：根据目标基因的序列，设计针对目标基因的特异性单导RNA(sgRNA)。
基因编辑：将sgRNA与Cas9蛋白表达载体转化植物，实现目标基因的敲除或敲低。
获得MiMe突变株：经过基因编辑后，获得基因敲除或敲低的MiMe突变株，这些突变株的生殖细胞在减数分裂时发生异常，转变为类似有丝分裂的分裂方式。
克隆配子生成：MiMe突变株产生的配子为未减数、克隆的配子，保持了母本的基因组成。
MiMe系统的建立：通过基因编辑构建的MiMe系统可以用于生成克隆配子，为多倍体基因组设计提供基础。
多倍体植物的产生：利用MiMe系统产生的克隆配子，可以通过杂交组合产生具有多个亲本基因组的多倍体植物。

表型和基因组验证：对多倍体植物进行表型和基因组分析，验证其基因组成和表型表现。
多倍体基因组设计：MiMe系统为多倍体基因组设计提供基础，从而可以精确控制多倍体植物的基因组成。
研究结果


1.构建减数分裂转有丝分裂”（MiMe）系统
研究者利用CRISPR/Cas9技术编辑了番茄基因，同时敲除了SlSPO11-1、SlREC8和SlTAM基因，建立了MiMe的系统。该系统导致番茄植株产生克隆配子而非通过减数分裂产生的配子。检测发现，MiMe番茄植株的花粉主要是非减数分裂产生的二倍体，且花粉粒体积增大。进一步分析显示，MiMe植株的果实重量减轻，种子数量减少，但种子体积增大，MiMe植株的种子产生的后代为四倍体，且四倍体种子具有正常的萌发率。


a. 建立MiMe系统的示意图。
b. 野生型和spo11-1 rec8 tam突变株的成熟花粉。
c. 野生型和MiMe突变株单朵花的成熟花粉直径分布。
d. 野生型和MbTMV-MTMiMe-A突变株的小孢子母细胞染色体行为。
e. MbTMV-MT F1和MbTMV-MTMiMe-A突变株的果实横切面解剖图。
f. 野生型和MbTMV-MTMiMe-A突变株每个果实中的种子数量。
g. MbTMV-MTMiMe-A亲本和MbTMV-MTMiMe-A后代的流式细胞术分析。
h. 通过叶片核的流式细胞术估计MbTMV-MTMiMe-A后代的倍性水平。

全基因组测序揭示，MiMe植株的后代在基因组水平上维持了杂合性，未发生基因重组。此外，MiMe植株的后代表现出稳定的表型，类似于F1杂交后代，而F2后代则展现出较高的表型变异。这些发现证明了MiMe系统成功实现了克隆配子的生成，并为进一步探索四倍体基因组设计提供了重要的基础。


i. MbTMV-MT F1植物、两个MbTMV-MT F2植物和两个四倍体MbTMV-MTMiMe-A后代的基因组测序和等位基因频率分析。
j. MbTMV-MT F1、MbTMV-MT F2和两个MbTMV-MTMiMe后代群体的植株高度时间序列。
k. MbTMV-MT F1、MbTMV-MTMiMe-A后代、MbTMV-MTMiMe-B后代和两个不同MbTMV-MT F2植物的果实形态。
2. 设计包含四个亲本基因组的四倍体植物

作者选择了MbTMV-MTMiMe和MaxezaMiMe这两个包含其两个亲本完整基因组的MiMe系统植株。将MbTMV-MTMiMe植株与MaxezaMiMe植株进行杂交，产生了F1代植株。这些F1代植株均为四倍体，含有四个亲本的完整基因组。
通过检测四个亲本特异的单核苷酸多态性标记，每个四倍体植株都被验证含有其四个亲本的完整基因组，从而证实了四倍体植株的基因组组成符合预期。
细胞学分析显示，四倍体植株具有48条染色体，这与预期的四倍体染色体数相符。此外，分析每个四倍体植株的基因剂量，确认了它们直接继承了亲本的基因组，未发生基因重组，这表明四倍体植株的基因组保持了亲本水平的异质性。


a. 生成四倍体4-Hap植物的示意图，包含其四个亲本的完整遗传信息。
b. MbTMV-MTMiMe x MaxezaMiMe后代、2个Maxeza F1植物、5个MbTMV-MTMiMe x FuntelleMiMe后代、2个Funtelle F1植物和3个MbTMV-MT F1植物的特异性标记存在情况。
c. 与b图类似，展示MbTMV-MTMiMe x FuntelleMiMe后代、2个Funtelle F1植物和3个MbTMV-MT F1植物的特异性标记存在情况。
d. 一个四倍体MbTMV-MTMiMe x FuntelleMiMe后代植物在减数分裂期中期I的染色体展开。
e. MbTMV-MT-FuntelleMiMe 和MbTMV-MT-MaxezaMiMe 4-Hap植物的预期基因剂量和全基因组测序基于的基因分型。
在表型观察中，四倍体植株展现了正常的生长发育和花果发育，并且具有更高的叶绿素含量，暗示了它们可能具有更好的光合效率。这些结果表明，通过四倍体基因组设计，研究者成功获得了包含四个亲本完整基因组的四倍体植株，为利用多倍性杂种优势提供了重要的可能性。


f. 染色体6上Mi-1抗性位点区域的基因组重排。从上到下依次是MbTMV、Micro-Tom和Funtelle-2和Funtelle-1的haplotype。
g. 每个基因组单倍型中来自S. peruvianum (Tm-22和Mi-1的供体)的基因频率。
h. 一个四倍体MbTMV-MTMiMe x FuntelleMiMe后代的整体植株形态、带成熟果实的枝条结构、完全成熟果实、收获的果实和切开的果实图片。
i. 左图是MbTMV-MT F1、Funtelle F1 和4个四倍体MbTMV-MT-FuntelleMiMe植物的单果实重量。右图是MbTMV-MT F1、Maxeza F1和12个四倍体MbTMV-MT-MaxezaMiMe植物的单果实重量。
研究结果

通过设计四倍体基因组，成功获得了包含四个亲本完整基因组的四倍体植株，这为利用多倍性杂种优势提供了重要可能性。这一设计策略可以控制四倍体植株的遗传组成，为利用多倍性杂种优势提供了可能性。四倍体植株的表型正常，并且具有更高的叶绿素含量，暗示了它们可能具有更好的光合效率。这些结果表明，通过四倍体基因组设计，研究者成功获得了包含四个亲本完整基因组的四倍体植株，为利用多倍性杂种优势提供了重要的可能性。

检验医师

同源重组技术(homologous recombination，HR)是较早使用的基因编辑技术，其原理是将外源性目的基因导入受体细胞，通过同源序列交换，使外源性DNA片段取代原位点上的基因，从而达到使特定基因失活或修复缺陷基因的目的。由于HR效率极低，且出错率高，因此其应用受到了一定的限制。
20世纪80年代末、90年代初，人们发现通过在特定的基因组靶点诱导双链断裂(double-stranded break，DSB)，能在染色体水平上实现高效和准确的基因修饰。
DSB被诱导后，细胞内将启动两种主要的修复机制：非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源定向修复（homology directed repair，HDR）。NHEJ不依赖模板直接连接DNA两端，可以在 DSB 位点有效产生不同长度片段的插入或缺失，通常导致基因功能失活；而在HDR中，断裂链依赖于模板进行定向修复，可以实现特定位点的精确插入、缺失或者碱基置换。
此后，科学家便专注于开发各种基于核酸内切酶机制的基因编辑技术，以实现对特定基因组位点DSB的精确诱导。



基因编辑技术原理（Torres-Ruiz R et al. Brief Funct Genomics. 2017）