实用技术干货！一文学会番红固绿染色实验

生物科研实验室

一、实验原理 番红（Safranin O）是一种碱性染料，可特异性地与木质素、角质等酸性成分结合，将细胞壁染成红色；固绿（Fast Green）作为酸性染料，则与纤维素、薄壁细胞的碱性成分结合，呈现蓝绿色。两者联合使用，能清晰区分植物的木质部、韧皮部、表皮等结构，也可用于动物组织纤维化病变的观察（如肝纤维化、肺纤维化）。 二、实验准备 1.样本类型：植物根/茎石蜡切片（厚度8-10μm）、动物纤维化组织切片。 2.试剂清单： •番红染色液：1%番红O水溶液（称取1g番红O溶于100ml蒸馏水，过滤后避光保存）。 •固绿染色液：0.1%固绿FCF（0.1g固绿溶于100ml 95%乙醇，加0.1ml冰醋酸助溶）。 •梯度乙醇（70%、85%、95%、100%）、二甲苯、中性树胶、1%盐酸乙醇（1ml浓盐酸+99ml 70%乙醇）。 3.关键器具：染色缸、温控烘箱、光学显微镜、封片用载玻片与盖玻片。 三、操作步骤 1. 脱蜡复水 将石蜡切片依次浸入二甲苯Ⅰ（10分钟）→二甲苯Ⅱ（10分钟）→100%乙醇（5分钟）→95%乙醇（5分钟）→85%乙醇（3分钟）→70%乙醇（3分钟）→蒸馏水（2分钟）。 注意事项：脱蜡不彻底会导至染色斑驳，务必观察切片是否完全透明；若切片脱落，可能是载玻片未涂粘片剂（建议用多聚赖氨酸预处理玻片）。 2. 番红染色 切片浸入1%番红液中染色2小时（室温），或60℃烘箱染色30分钟。染色后流水冲洗5秒，去除浮色。 关键细节：染色时间根据样本调整，木质化程度高的植物组织可延长至4小时；动物组织通常1小时足够。 3. 分化去冗余 将切片快速浸入1%盐酸乙醇（1-3秒），显微镜下控制分化程度至细胞核清晰、细胞质微红即可。分化后立即用流水冲洗10分钟终止反应。 警告：分化过度会导至红色完全褪去，新手建议先拿废片练习手感！ 4. 脱水过渡 依次浸入70%乙醇（1分钟）→85%乙醇（1分钟）→95%乙醇（1分钟）。此步骤既能脱水，也为后续固绿染色创造碱性环境。 5. 固绿复染 切片浸入0.1%固绿乙醇液复染30秒-1分钟（镜下观察薄壁细胞呈淡蓝绿色为佳），迅速用95%乙醇分色2秒，再浸入100%乙醇脱水2分钟。 技巧：固绿染色时间宁短勿长，过度染色会掩盖番红信号。 6. 透明封片 切片经二甲苯Ⅰ（2分钟）→二甲苯Ⅱ（2分钟）透明后，滴加中性树胶，倾斜盖玻片缓慢覆盖，避免气泡。封片后置于37℃烘箱固化24小时。 注意：二甲苯透明不彻底会导至切片发白，树胶过多则溢出污染镜头。 四、显微镜观察 将切片置于光学显微镜下，先用10倍物镜定位目标区域，转至40倍观察细节。调整聚光器光圈至中等大小（增强对比度），若红色信号偏暗可降低光源亮度。 结果判定：植物木质部细胞鲜红色，韧皮部蓝绿色；动物胶原纤维蓝绿色，细胞核红色。 五、常见问题与解决方案 问题1：切片整体发红，无蓝绿色对比 •原因：固绿染色失败或分化不足。 •解决：重新脱蜡至95%乙醇，延长固绿染色时间至2分钟；或缩短番红染色时间。 问题2：切片褪色或出现结晶 •原因：脱水不彻底或封片胶混入水分。 •解决：重新脱水透明，确保乙醇-二甲苯梯度严格无水；更换新开封的中性树胶。 问题3：染色不均匀，呈斑块状 •原因：脱蜡不完全或染色液沉淀。 •解决：延长二甲苯脱蜡时间至15分钟/缸；染色前用滤纸过滤染料。 问题4：切片碎裂或脱落 •原因：组织脱水不充分或切片过薄。 •解决：重新优化脱水程序（乙醇梯度每步延长2分钟）；切片厚度调整为10μm。 六、实验经验 •染色液每2周更换一次，避免氧化失效。 •分化步骤必须实时镜下监控，经验不足者可分次浸入盐酸乙醇（每次1秒，间隔水洗观察）。 •封片时盖玻片与载玻片呈30°角接触，缓慢压下以减少气泡。