多色荧光原位杂交（Multiplex FISH）实验

wolf

一、实验原理

荧光原位杂交（FISH）通过荧光标记的DNA探针与样本中的目标DNA/RNA序列结合，在显微镜下显示不同颜色的荧光信号，用于检测基因位置、拷贝数或染色体异常。多色FISH可同时使用多种探针（不同颜色）分析多个靶点。
二、实验前准备

1. 试剂与材料

• 样本：细胞爬片、石蜡切片或冰冻切片。
  
• 探针：预标记的荧光探针（如Cy3、FITC、Texas Red标记）。
  
• 试剂：
  
  
  
  • 20× SSC缓冲液（稀释成2× SSC和0.1× SSC）
    
  • 甲酰胺（用于变性，毒性强，需在通风橱操作）
    
  • 去离子甲酰胺（降低背景）
    
  • DAPI（染细胞核）
    
  • 抗褪色封片剂（如Vectashield）
    
  • 蛋白酶K（用于组织切片预处理）
    
  • 乙醇梯度（70%、85%、100%）
    
  
  
• 耗材：盖玻片、载玻片、湿盒（可用培养皿垫湿滤纸代替）、杂交盒。
  

2. 仪器

• 荧光显微镜（配备不同滤光片：DAPI/FITC/Cy3/Texas Red）
  
• 恒温水浴锅或PCR仪（控温精确）
  
• 烘箱或电热板（用于玻片干燥）
  

三、实验步骤详解

1. 样本预处理（以细胞爬片为例）

• 固定：细胞用4%多聚甲醛（PFA）室温固定10分钟，PBS洗3次×5分钟。
  
• 透化：加入0.5% Triton X-100（PBS配制）透化10分钟，PBS洗3次。
  
• 蛋白酶处理（仅需组织切片）：滴加蛋白酶K（10 μg/mL）室温消化5-10分钟，PBS终止。
  

2. 探针与样本变性

• 探针变性：将探针混合物（含目标探针+封闭DNA+杂交液）在75℃水浴中加热5分钟，立即冰浴2分钟。
  
• 样本DNA变性：滴加70%甲酰胺/2× SSC溶液于玻片上，盖上盖玻片，75℃加热5分钟（细胞）或8分钟（组织），立即用预冷的70%乙醇脱水，梯度乙醇（85%→100%）各2分钟，晾干。
  

3. 杂交

• 加探针：将变性后的探针（10-20 μL/片）滴在样本上，加盖玻片（避免气泡），用橡胶水泥封边。
  
• 孵育：放入湿盒（防止干燥），37℃避光杂交过夜（16-18小时）。
  

4. 洗脱与封闭

洗脱非特异性结合：

小心移除盖玻片，依次用以下溶液洗涤：

• 2× SSC（室温）5分钟 →
  
• 0.1× SSC/50%甲酰胺（42℃）15分钟 →
  
• 2× SSC（42℃）5分钟 →
  
• 1× PBS（室温）5分钟。
  

封闭（可选）：滴加封闭液（如5% BSA/PBS）室温孵育30分钟，减少背景。
5. 复染与封片

• 染细胞核：滴加含DAPI（1 μg/mL）的抗褪色封片剂，加盖玻片，避光静置10分钟。
  
• 封片：用指甲油或专用封片胶密封盖玻片边缘，4℃避光保存。
  

6. 观察与拍照

• 立即用荧光显微镜观察：
  
  
  
  • DAPI通道：定位细胞核（蓝色）→
    
  • 其他通道（如FITC/Cy3/Texas Red）：寻找目标信号（绿/红/远红色）。
    
  
  
• 拍照时关闭室内光源，使用相同曝光时间保存图片以便后期分析。
  

四、注意事项（小白必看！）

防污染：全程戴手套，避免RNase污染（尤其是RNA-FISH）。
避光操作：探针和封片剂需避光保存，操作时尽量在暗处。
温度控制：变性温度和时间需精确，过度变性会损伤样本，不足则杂交效率低。
背景高怎么办？

增加洗涤时间或甲酰胺浓度，或减少探针用量。
信号弱怎么办？

延长杂交时间至24小时，或提高探针浓度。
五、常见问题解答

• Q1：探针可以重复使用吗？
  不建议！探针反复冻融或长时间保存会导致荧光淬灭。
  
• Q2：为什么看不到信号？
  检查显微镜滤光片是否匹配探针荧光，或重新优化变性条件。
  
• Q3：组织切片容易脱落怎么办？
  使用多聚赖氨酸包被的玻片，或缩短蛋白酶K消化时间。
  

六、试剂配方

• 杂交液（现用现配）：
  

• 50% 去离子甲酰胺
  
• 10% 硫酸葡聚糖
  
• 2× SSC
  
• 1 μg/μL 鲑鱼精DNA（封闭非特异性结合）
  

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