流式细胞仪？

会里很

请教一下各位大神，流式细胞仪点图上面每个点就代表一个细胞，那细胞数不是直接就出来了吗？为什么点图软件直接分析出来的是百分比呢？

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清风寡欲

1. MACSQuant® Tyto® 流式细胞分选仪的原理

美天旎生物技术基于无菌性、安全性、温和分选及易用性四大核心目标开发了MACSQuant® Tyto®流式细胞分选仪。该仪器采用封闭分选舱系统中的机械阀门实现分选，无需鞘液系统。本章将详细阐述分选原理及相关分选阀时序，并对比传统液滴分选仪与MACSQuant Tyto的工作流程和技术差异，同时重点解析分选舱系统的安全性、稳定性以及连续分选步骤的可操作性。
1.1 MACSQuant Tyto的细胞分选原理

MACSQuant Tyto的分选过程在完全封闭的MACSQuant Tyto分选舱内完成。分选舱包含三个腔室：进样室、阳性收集室及阴性回收室。  
分选前，荧光标记的细胞被加载至进样室，该室配备可调节的搅拌器以维持细胞悬浮状态。通过压力入口施加至进样室的低压空气（<3 psi，即<20.7 kPa）驱动细胞从进样室经微通道流入含有分选阀的微芯片中。在微芯片内、分选阀前端，细胞接受三束激光的检测。由激光激发的荧光信号及散射光信号用于区分阴性细胞与目标细胞。阴性细胞默认流向阴性回收室；而目标细胞则通过施加磁场触发微芯片内的分选阀开启，从而改变液流方向，使其进入阳性收集室。



图1. 在MACSQuant Tyto分选舱中得的细胞分选

1.2 分选阀原理​​

当MACSQuant Tyto分选舱置入MACSQuant Tyto仪器时，一个螺线管被定位在微芯片附近。螺线管通电后，会吸引含有镍/铁磁芯的微阀，从而改变微芯片内的液流方向。默认状态下，细胞流向阴性回收室；当微阀门向螺线管方向移动时，细胞被引导至阳性收集室。断电后，硅胶弹簧将微阀门复位至初始位置
精确的阀门启闭是实现正负细胞有效分离的关键。为此，仪器需精准预测目标细胞到达分选阀的时机。
​​1.2.1 飞行时间（TOF）测量​​
为预测目标细胞到达分选阀的时间，需通过测量飞行时间（TOF）确定其流速。具体而言，TOF定义为细胞在两个相邻激光束之间穿行所需的时间，该时间通过两个光电倍增管（PMT）通道（即触发通道与细胞速度通道）同步测量。触发通道用于设定阈值，以指示仪器判定何种事件应视为阳性信号（即目标细胞）。
由于MACSQuant Tyto分选舱芯片微通道内的流速存在差异，因此最好根据最接近分选阀门的相邻激光选择触发和细胞速度通道。这种设置可以实现最佳的细胞速度测定。推荐触发/细胞速度激光组合的示意图如下。



图2. MACSQuant Tyto推荐的触发/细胞速度激光组合的概览

关于分选阀时序的详细操作说明，可通过相关页面下载简短指南。
​​1.2.2 细胞速度阈值​
通过考虑在触发通道处超过预定义荧光强度水平的所有细胞，确定平均TOF，该荧光强度水平被称为细胞速度阈值。根据平均TOF，仪器会自动调整输入腔的分选压力。此机制的实用性在于：通过将细胞速度阈值设定略低于目标细胞群的荧光强度水平，可调节分选舱微通道内的液流状态，从而为高精度分选创造最优条件。此外，这一策略还能有效降低平均TOF测定过程中噪声的干扰。
1.3 细胞分选目标​

理想状态下，细胞分选应同时实现高速度、高纯度与高得率（参见下图A）。然而实际操作中，分选性能始终是三者的折中平衡。在速度恒定的前提下，追求最高纯度通常需牺牲得率（B）；反之，追求高得率则会导致纯度下降（C）。类似地，若选择高分选速度，纯度与得率均会受到影响（D）。这一原则适用于市场上所有现有分选设备。
MACSQuant Tyto提供三种分选算法模式：得率优先模式、纯度优先模式及平衡模式。得率优先模式下，算法专门筛选所有被判定为阳性的事件；纯度优先模式则侧重筛选独立的单一阳性事件，以提高阳性分选群体的纯度；平衡模式则在纯度与得率间取得折中。根据不同应用及参数设置（纯度、得率或平衡模式），该仪器可实现高达99%的纯度及>70%的得率。
需要注意得是，最终纯度与得率始终受其他因素影响，包括分选细胞类型、输入样本中的细胞密度，以及目标细胞在输入样本中的浓度等。



图2. 纯度、得率和分选速度之间的相互关系。

1.4 MACSQuant Tyto分选仪的优势特性及与传统液滴分选仪的对比​

​​1.4.1 工作流程特性​​

• 实验人员无需高强度培训即可轻松操作仪器。
  
• 分选舱通过条形码扫描自动识别类型与批次。
  
• 分选舱装载采用直观的“即插即用”方式。
  
• 液流控制、激光校准、速度检测及阀门时序均全自动完成。
  
• 针对多种应用的自动分选设置功能进一步简化操作。实际分选过程无需人工干预，节省时间、资源及成本。
  

​​整体手动操作时间对比​​
下表对比了MACSQuant Tyto与常规液滴分选仪在2.5小时典型分选任务中的操作耗时。

液滴式分选仪	MACSQuant Tyto 分选仪
步骤	时间	步骤	时间
设备/软件启动液流启动和稳定喷嘴选择和设置鞘液压力定义分选设置调整液滴驱动振幅和频率聚焦侧流液滴延迟计算打开液路监测瞄准分选流设备质控	00:30–01:00 小时	设备/软件启动定义分选设置设备质量控制	00:15 小时
实验设置	00:05 小时	实验设置分选舱填充和对齐	00:10 小时
分选	02:30 小时 – 需要操作员	分选	02:30 小时 – 无需操作员
清洁	00:05 小时 – 用户间清洁（无需更换流体）	清洁	不需要
关闭	00:20 小时 – 完全关闭	关闭	≤ 00:01 小时
操作员操作仪器总用时	≥ 03:30–04:00 小时	操作员操作仪器总用时	≥ 00:26 小时

​​1.4.2 技术特点
MACSQuant Tyto的技术具有独特性。下表列举了其相较于传统液滴分选仪的核心技术优势。

液滴式分选仪	MACSQuant Tyto 分选仪
特点	特点	优势
涉及仪器中的流体系统	完全封闭的分选舱系统	确保操作员安全以及样本完整性和无菌性。无样本间交叉污染
需要鞘液	不涉及鞘液	无细胞被污染鞘液污染的风险
分选后阴性细胞不可用	分选舱内收集阴性细胞	可从同一样本分选不同群体或对同一群体进行再分选以提高纯度
细胞在离开喷嘴时暴露于严苛的减压条件	在MACSQuant Tyto上进行分选时，气压低于3 psi（20.7 kPa）	温和的细胞分选过程
细胞被充电以在电场中偏转	MACSQuant Tyto上的分选基于能够执行30,000次/秒的机械阀门，不对细胞充电	温和的细胞分选过程
喷嘴堵塞时需要立即采取行动以保护已分选的群体并减少操作员暴露于潜在危险气溶胶	堵塞情况下，样本安全地保留在输入腔内，可用于进一步分选	允许无需操作员干预的分选。无需立即采取行动即可保持操作员安全以及样本和已分选部分的完整性

1.5 MACSQuant Tyto分选舱的特点和优势

​​1.5.1 安全性​​
MACSQuant Tyto分选舱在分选过程中确保了高度的安全性。

• MACSQuant Tyto分选舱的所有腔室均配备0.1 µm疏水滤膜，允许样本进行无菌通气。
  
• 用于对输入腔加压以控制分选流的空气预先经过过滤。
  
• 所有的MACSQuant Tyto分选舱都经过严格监控和验证的环氧乙烷灭菌过程，确保完全无菌。
  

​​1.5.2 稳定性​​
MACSQuant Tyto分选舱支持可靠且稳健的细胞分选流程：

• 在输入腔内的微通道前方设有3D滤网，用于截留较大的颗粒和聚合物，防止分选阀门堵塞。
  
• 如果微通道发生堵塞，瞬间的高振动液体流有助于溶解堵塞物。
  
• 如果微通道持续堵塞，与传统液滴式分选仪不同，MACSQuant Tyto分选舱允许完全回收样本，且不会使分选的组分存在交叉污染的风险。只需将剩余样本从输入腔中移出，装入一个新的分选舱，即可继续分选过程。
  
• 在分选过程中，仪器会根据微芯片上的标记持续执行自动激光重新对准，以确保整个过程的最优分选条件。
  
• 自动化的流速控制、速度检测和阀门定时使得整个分选过程无需操作人员干预。
  

​​1.5.3 单样本连续分选​​
在MACSQuant Tyto上对特定目标细胞群体进行分选时，未分选的非目标细胞被收集在阴性分选腔中，因此可用于进一步的分选步骤。这一功能有三个用途。
可通过对稀有目标细胞群体（<0.05%的原始样本）进行两步分选来实现高纯度分选：首先进行以高得率为重点的初步分选，然后进行以高纯度为目标的额外分选。
在初步分选后，若要提高得率，可对阴性群体进行同样的处理，以从该群体中获得更多目标细胞。这种方法对于分离稀有细胞群体，如肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）或使用珍贵的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）材料时非常有帮助。
MACSQuant Tyto允许从单个样本中分选多个群体。由于分选后保留了阴性部分，因此可以对该部分进行后续分选，以获得功能不同的群体。
​​1.6 MACSQuant Tyto的应用

有关MACSQuant Tyto不同应用的概览，请参阅我们网站上的应用页面，该页面提供了以下细胞分选的数据：

• 抗原特异性T细胞
  
• 调节性T细胞
  
• 从单个样本中分选B细胞、T细胞和NK细胞
  
• 从单个样本中分选不同的NK细胞群体
  
• 中性粒细胞
  
• 诱导多能干细胞
  
• 间充质干细胞
  
• CD133+干细胞
  
• 酵母细胞
  
• 细菌