微生物培养基配制过程有哪些注意事项？

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微生物培养基配制过程有哪些注意事项？
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长长的路

藻类培养和培养条件

本研究中使用的两种菌落形成微囊藻菌株的纯培养物铜绿微囊藻CHAB 5059和威森伯格微囊藻CHAB 1211由李仁辉教授（中国科学院水生物研究所，武汉，中国）提供。有毒的铜绿假单胞菌菌落含有大量的MC-LR和MC-RR。在卫森伯格支原体细胞中未检测到MCs。如前所述（Tan等人，2010年）分离菌株，并在25°C条件下，在MA培养基中以12小时光照/12小时暗循环培养（Kasai等人，2004年）。在实验之前，对培养物进行放大，直到每个菌落形成微囊藻菌株获得足够的生物量。在整个培养过程中，每个菌株的菌落特征保持不变。

沉积物和水

沉积物和水来自东湖（北纬30°33.0367N，东经114°22.4832E）。沉积物通过60μm的筛子过滤，以防含有可能损坏微电极的大颗粒（OXY25，Unisense，丹麦）。一小部分沉积物经过冷冻干燥、粉碎，并通过60μm的筛子。湖水通过0.45μm的醋酸纤维素膜过滤以去除藻类。

实验环境

本实验使用塑料注射器（50ml）；注射器筒的顶部被切断，底部用橡胶柱塞密封（图1）。沉淀物、藻类和过滤水被一层一层地添加到桶中。首先，添加15毫升沉积物作为初始层。添加沉淀物和菌落微囊藻（3 mL）的混合物作为第二层。第三层和第四层分别与第一层和第二层相同。接下来，将0.5g冻干沉淀物均匀地洒在第四层上。最后，缓慢添加10毫升过滤后的湖水作为第五层，以模拟沉积物和微囊藻的再悬浮。注射器筒的外部覆盖着锡箔，顶部覆盖着透气膜。为了比较有毒铜绿假单胞菌和无毒威森伯格假单胞菌的存活能力，将这些装置分为三组，并添加了各种藻类。第一组中添加铜绿微囊藻，第二组中添加魏森伯格微囊藻。在第三组中，将等量的绿脓杆菌和威森贝格氏杆菌混合并添加到桶中（称为微囊藻属）。三组微囊藻菌落的细胞密度均为2.3×108±1.2×107。将微宇宙（图1）置于培养箱中，并在三种不同温度（5、15和25°C）下保持在黑暗中。




图1模拟微囊藻群落的底栖环境

使用微电极（OXY25，Unisense，丹麦）测量水-沉积物界面的氧气分布，如之前的研究（Tian等人，2015）所述。

取样

我们的前期实验表明，微囊藻菌落的寿命随温度变化很大。因此，针对不同的温度设置了不同的采样间隔。实验持续了22周，每1周、2周或4周采集一次样本。每次取样时，从每组中随机抽取两桶进行取样。

去除覆盖水后，用柱塞杆缓慢排出沉积物芯（图1）。将两层混合沉淀物和微囊藻菌落（即第二层和第四层）切掉并转移到50 mL离心管中，并向每根管中添加15 mL 40%Percoll（瑞典阿默森生物科学公司）溶液。充分混合后，将混合物以4000×g离心10分钟。将含有微囊藻菌落的上清液通过孔径为10μm的筛网过滤，以收集所有蓝藻菌落。然后轻轻冲洗筛子上的微囊藻菌落，并将其悬浮在10毫升MA培养基中，以供日后分析。

微囊藻细胞密度的测定

为了计数底栖微囊藻，将含有微囊藻菌落的10mL MA培养基的等份（各1mL）用0.01mol L水解−如前所述（Wang等人，2015），在85°C温度下使用NaOH进行8分钟，并使用流动摄像机和显微镜（FlowCAM）进行自动研究。

存活率在沉积物中存活一段时间的微囊藻细胞百分比被用来代表微囊藻菌落在不同环境条件下的存活率。

微囊藻的光化学效率分析

PSII的最大光化学效率（Fv/Fm）是使用脉冲调幅荧光监测系统（德国沃尔兹Phyto PAM）测量的。暗适应5分钟后，在弱光条件下（0.15μmol/m）测量原始荧光（Fo）和最大荧光（Fm）−2秒−1）以及3516μmol/m的饱和光脉冲−2秒−分别为1，持续0.8秒。PSII的最大光化学效率（Fv/Fm）计算为Fv/Fm=（Fm）−Fo）/Fm（Wang等人，2014年）。

微囊藻毒素的提取与测定

在4°C条件下，使用3毫升100%甲醇（最终浓度为75%）在含有微囊藻菌落的10毫升MA培养基中提取等份（各1毫升）的MC 24小时。离心后，使用由Waters 2695分离模块、Waters 2996光电二极管阵列检测器和Waters Empower色谱软件（Waters，USA）组成的系统，通过高效液相色谱法（HPLC）测定上清液中的MC含量（Wu等人，2009）。通过比较238nm处的峰面积与MC标准品（美国西格玛·奥尔德里奇）的峰面积来确定MCs的浓度，并在Synergi Hydro RP C18柱（4μm，250mm×4.6mm）上分离MCs。

统计分析

通过重复方差分析（ANOVA）考察了温度、微囊藻种类和沉积层对存活率、光化学效率和微囊藻毒素含量的影响。数据以平均值±标准偏差（SD）表示。Mauchly检验用于通过重复方差分析评估球形度，温室-盖瑟球形度估计用于纠正违反Mauchly检验的数据中的自由度。在三因素重复方差分析中发现显着交互作用的情况下，对每个温度进行单因素方差分析。在进行单因素方差分析后，进行事后Tukey检验以确定显着分组。所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics 19软件（美国IBM公司）进行。使用Origin 8.0软件（美国OriginLab）生成图形。

来自：湖泊沉积物中微囊藻群落生存能力的定量研究：摘要、介绍、材料和方法-上海谓载科技有限公司

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微生物培养基配制是微生物应用过程中最重要的一环。
都认为配制培养基很简单，事实上是简单，但是关键，培养基配不好，后面的一切都是免谈。
微生物培养基配制注意事项：
1 配方

• 严格按照培养基配方进行配制，优化配方除外。
  
• 有人认为多加点少加点没影响，实际上，影响在慢慢积累，一代可能看不出来，次数多了肯定能看出来。
  

2 原料

• 原料对微生物的生长影响很大，同样是玉米浆，不同的生产厂家生产的玉米浆可能都不同。最后反应在对微生物的新陈代谢上。所以，如果遇到好的原料，一定要备份，以备后续核验。
  
• 为什么要留样？比如说，玉米浆属于副产物，很有可能同一厂家不同批次的玉米浆也有可能有差异，如果遇到实验出问题，正好换了玉米浆，就可以检测玉米浆的成分，检测一下玉米浆成分，对比现有的原料和以前有什么差异。
  

3 水的问题

• 水的问题也不容忽视。
  
• 不同的水含有矿物质是不同的，严格按照要求用水。
  
• 既然给出了配方用水，就要按照要求使用，如果没有，那就按照正常使用。
  

4 溶解问题

• 尤其是不能溶解的颗粒物。比如说豆粕、豆饼粉、碳酸钙等。如果是配制固体培养基，倒平板前一定要摇匀。
  

5 pH

• 适宜的pH条件，对微生物生长代谢至关重要，pH过高过低影响都很大。
  
• 不同批次的原料有时候pH也有差异，所以配制好后一定要测一下溶液pH。
  

暂且这么多吧。

感恩由您

1.牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养）
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.4～7.6。

2.高氏1号培养基(用于放线菌培养)
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4•3H2O 0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，水1000mL，pH7.4～7.6。配制时注意：可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中。

3.马丁氏（Martin）培养基（用于从土壤中分离真菌）
K2HPO41g，MgSO4•7H2O0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，1/3000孟加拉红水溶液100mL，水900mL，自然pH，121℃湿热灭菌30min。待培养基融化后冷却55～60℃时加入链霉素(链霉素含量为30μg/mL)。

4.马铃薯培养基(PDA)(用于霉菌或酵母菌培养)
马铃薯(去皮)200g，蔗糖(或葡萄糖)20g，水1000mL，配制方法如下：
将马铃署去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，再补足至1000mL，自然pH，霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。

5.察氏培养基(蔗糖硝酸钠培养基)(用于霉菌培养)
蔗糖30g，NaNO3 2g，K2HPO4 1g，MgSO4•7H2O0.5g，KCl 0.5g，FeSO4•7H2O0.1g，水1000mL，pH7.0～7.2。

6.Hayflik培养基(用于支原体培养)
牛心消化液(或浸出液)1000mL，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，pH7.8～8.0，分装每瓶70mL，121℃湿热灭菌15min，待冷却至80℃左右，每70mL中加入马血清20mL，25%鲜酵母浸出液10mL，15醋酸铊水溶液2.5mL，青霉素G钾盐水溶液(20万单位以上)0.5mL，以上混合后倾注平板。
*注意：醋酸铊是极毒的药品，需特别注意安全操作。

7.麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基)
葡萄糖0.1g, KCl 0.18g，酵母膏0.25g，醋酸钠0.82g，琼脂l.5g，蒸馏水l00mL。溶解后分装试管，1l5℃湿热灭菌15min。

8.葡萄糖蛋白胨水培养基(用于V.P.反应和甲基红试验)
蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，K2HPO4 0.2g，水100mL，pH7.2，1l5℃湿热灭菌20min。

9.蛋白胨水培养基(用于吲哚试验)
蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.2～7.4，121℃湿热灭菌20min。

10.糖发酵培养基(用于细菌糖发酵试验)
蛋白胨0.2g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.02g，水100mL，溴麝香草酚蓝(1%水溶液)0.3mL，糖类lg。分别称取蛋白胨和NaCl溶于热水中，调pH至7.4，再加入溴麝香草酚蓝(先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)，加入糖类，分装试管，装量4～5cm高，并倒放入一杜氏小管(管口向下，管内充满培养液)。115℃湿热灭菌20min。灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷空气排尽以使杜氏小管内不残存气泡。常用的糖类，如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等(后两种糖的用量常加大为1.5%)。

11.RCM培养基(强化梭菌培养基)、(用于厌氧菌培养)
酵母膏3g，牛肉膏l0g，蛋白胨10g，可溶性淀粉lg，葡萄糖5g, 半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl 3g，NaAc 3g，水l000mL，pH8.5，刃天青3mg/L，l2l℃湿热灭菌30min。

12.TYA培养基(用于厌氧菌培养)
葡萄糖40g，牛肉膏2g，酵母膏2g，胰蛋白胨(bacto-typetone)6g，醋酸铵3g，KH2PO4 0.5g，MgSO4•7H2O0.2g，FeSO4•7H2O0.01g，水1000mL， pH6.5，121℃湿热灭菌30min。

13.玉米醪培养基(用于厌氧菌培养)
玉米粉65g，自来水1000mL，混匀，煮10min成糊状，自然pH，121℃湿热灭菌30min。

14.中性红培养基(用于厌氧菌培养)
葡萄糖40g，胰蛋白胨6g，酵母膏2g，牛肉膏2g，醋酸铵3g，KH2PO4 5g，中性红0.2g，MgSO4•7H2O0.2g，FeSO4•7H2O0.01g, 水1000mL，pH6.2，121℃湿热灭菌30min。

15.CaCO3明胶麦芽汁培养基(用于厌氧菌培养)
麦芽汁(6波美)1000mL，水1000mL，CaCO310g，明胶10g，pH6.8,121℃湿热灭菌30min。

16.BCG牛乳培养基(用于乳酸发酵)
(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。
(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8,121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。

17.乳酸菌培养基(用于乳酸发酵)
牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g，NaCl 5g，水1000mL，pH6.8，121℃湿热灭菌20min。

18.酒精发酵培养基(用于酒精发酵)
蔗糖10g,MgSO4•7H2O0.5g,NH4NO30.5g,20%豆芽汁2mL，KH2PO4 0.5g，水100mL，自然pH。

19.柯索夫培养基(用于钩端螺旋体培养)
优质蛋白胨0.4g, NaCl0.7g,KCl 0.02g, NaHCO3 0.01g，CaCl 0.02g，KH2PO40.09g，NaH2PO40.48g，蒸馏水500mL，无菌兔血清40mL。
制法：除兔血清外的其余各成分混合，加热溶解，调pH至7.2，121℃湿热灭菌20min，待冷却后，加入无菌兔血清，制成8%血清溶液，然后分装试管（5～10mL/管），56℃水浴灭活lh后备用。

20.豆芽汁培养基
黄豆芽500g，加水1000mL，煮沸lh，过滤后补足水分，121℃湿热灭菌后存放备用，此即为50%的豆芽汁；
用于细菌培养：10%豆芽汁200mL，葡萄糖(或蔗糖)50g，水800mL，pH7.2～7.4。
用于霉菌或酵母菌培养：10%豆芽汁200mL，糖50g，水800mL，自然pH。霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。

21.LB(Luria—Bertani)培养基(细菌培养，常在分子生物学中应用)
双蒸馏水950mL，胰蛋白胨l0g，NaCl l0g，酵母提取物(bacto- yeast extract)5g，用lmol/L NaOH (约l mL) 调节pH值至7.0，加双蒸馏水至总体积为1L，121℃湿热灭菌30min。
含氨苄青霉素LB培养基：待LB培养基灭菌后冷至50℃左右加入抗生素，至终浓度为80～100mg/L。

22.复红亚硫酸钠培养基(远藤氏培养基)
蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g，琼脂20g，乳糖10g，K2HPO40.5g，无水亚硫酸钠5g，5%碱性复红乙醇溶液20mL，蒸馏水1000mL。
制作过程：先将蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏和琼脂加入到900mL水中，加热溶解，再加入K2PO4，溶解后补充水至l000mL，调pH至7.2～7.4。随后加入乳糖，混匀溶解后，于115℃湿热灭菌20min。再称取亚硫酸钠至一无菌空试管中，用少许无菌水使其溶解，在水浴中煮沸10min后，立即滴加于20mL5%碱性复红乙醇溶液中，直至深红色转变为淡粉红色为止。
将此混合液全部加入到上述已灭菌的并仍保持融化状态的培养基中，混匀后立即倒平板，待凝固后存放冰箱备用，若颜色由淡红变为深红，则不能再用。

23.乳糖蛋白胨半固体培养基(用于水体中大肠菌群测定)
蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，酵母膏5g，乳糖10g，琼脂5g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4，分装试管(l0mL/管)，115℃湿热灭菌20min。

24.乳糖蛋白胨培养液(用于多管发酵法检测水体中大肠菌群)
蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，蒸馏水l000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液lmL。调pH至7.2，分装试管(l0mL/管)，并放入倒置杜氏小管，l15℃湿热灭菌20min。

25.三倍浓乳糖蛋白胨培养液(用于水体中大肠菌群测定)
将乳糖蛋白胨培养液中各营养成分以扩大3倍加入到l000mL水中，制法同上，分装于放有倒置杜氏小管的试管中，每管5mL，1l5℃湿热灭菌20min。

26.伊红美蓝培养基(EMB培养基)(用于水体中大肠菌群测定和细菌转导)
蛋白胨l0g，乳糖10g，K2HPO4 2g，琼脂25g，2%/伊红Y(曙红)水溶液20mL,0.5%美蓝(亚甲蓝)水溶液l3mL，pH7.4。
制作过程：先将蛋白胨、乳糖、K2HPO4和琼脂混匀，加热溶解后，调pH至7.4，1l5℃湿热灭菌20min，然后加入已分别灭菌的伊红液和美蓝液，充分混匀，防止产生气泡。待培养基冷却到50℃左右倒平皿。如培养基太热会产生过多的凝集水，可在平板凝固后倒置存于冰箱备用。在细菌转导实验中用半乳糖代替乳糖，其余成分不变。

27.加倍肉汤培养基(用于细菌转导)
牛肉膏6g，蛋白胨20g，NaCl 10g，水1000mL，pH7.4～7.6。

28.半固体素琼脂(用于细菌转导)
琼脂1g，水100mL，121℃湿热灭菌30min。

29.豆饼斜面培养基(用于产蛋白酶霉菌菌株筛选)
豆饼100g加水5～6倍，煮出滤汁100mL，汁内加入KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%,(NH4)2SO4  0.05%，可溶性淀粉2%，pH6，琼脂2%～2.5%。  

30.酪素培养基(用于蛋白酶菌株筛选)
分别配制A液和B液。
A液：称取Na2HPO4•7H2O1.07g。干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解。
B液：称取 KH2PO4 0.36g，加水溶解。A、B液混合后，加入酪素水解液0.3 mL，加琼脂20g，最后用蒸馏水定容至1000mL。
酪素水解液的配制：1g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL，30℃水解l h。用于配制培养基时，其用量为1000mL，培养基中加入100mL以上水解液。

31.细菌基本培养基(用于筛选营养缺陷型)   
Na2HPO4•7H2O1g，MgSO4•7H2O0.2g，葡萄糖5g，NaCl 5g，K2HPO4lg，水l000mL，pH7.0，1l5℃湿热灭菌30min。

32.YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)
酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，115℃湿热灭菌20min。

33.YEPD高渗培养基(用于酵母原生质体融合)
在YEPD培养基中加入0.6mol/L的NaCL，3%琼脂。

34.YNB基本培养基(用于酵母原生质体融合)
0.67%酵母氮碱基(YNB, 不含氨基酸，Difco),2%葡萄糖，3%琼脂，pH6.2。
另一配方为：葡萄糖10g(NH4)2SO4 1g，K2HPO40.125g，KHPO4 0.875g，KI 0.0001g，MgSO4•7H2O0.5g，CaCl2•2H2O0.lg，NaCl0.1g，维量元素母液lmL，维生素母液lmL(母液均按常规配制)，水1000mL，pH5.8～6.0。

35.YNB高渗基本培养基(用于原生质体融合)
在YNB基本培养基中加入0.6mol/LNaCl。

36.酚红半固体柱状培养基(用于检查氧与菌生长的关系)
蛋白胨1g，葡萄糖10g, 玉米浆10g，琼脂7g，水1000mL，pH7.2。在调好pH后，加入1.6%酚红溶液数滴，至培养基变为深红色，分装于大试管中，装量约为试管高度的1/2，1l5℃灭菌20min。细菌在此培养基中利用葡萄糖生长产酸，使酚红从红色变成黄色，在不同部位生长的细菌，可使培养基的相应部位颜色改变,但注意培养时间太长，酸可扩散以致不能正确判断结果。
<hr/>以上各种培养基均可配制成固体或半固体状态，只需改变琼脂用量即可，前者为1.5%～2.0%，后者为0.3%～0.8%。

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什么是培养基？

微生物需要营养，营养是指微生物生长与繁殖所需的能量来源和特定环境条件。在自然环境中，微生物已经适应了最适合其需要的栖息地。然而在实验室中，这些要求必须通过培养基来满足。培养基基本上是一种水溶液，其中添加了所有必需的营养成分。根据营养成分的类型和组合，可以制做不同类别的培养基。
差异性培养基/选择性培养基 | 复合培养基 | 成份确定的培养基

复合培养基营养丰富，含有植物或动物组织的水溶性提取物（例如蛋白胨和胰蛋白胨之类的酶消化的动物蛋白）。通常加入糖（常常是葡萄糖），作为主要的碳和能量来源。提取物与糖的组合产生富含矿物质和有机营养成分的培养基，但由于确切的组成成分未知，因此培养基称为复合物。

成份确定的培养基是指精确计量浓度的纯成分溶解于双蒸水所制成的培养基（即培养基的确切化学组成是已知的）。通常，它们含有简单的糖作为碳和能量来源，是一种无机氮源，另外还含有各种矿物盐和必要的生长因子（纯化的氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶）。

选择性/差异性 培养基是基于上述复合或成份确定的培养基而制成的培养基，并补充有促进或抑制生长的添加剂。添加剂可以是物种或生物选择性的（例如特定底物，或者抑制所有真核生长的抑制剂，例如环己酰胺（artidione，放线菌酮），并且通常用于防止混合培养物中的真菌生长）。
必需营养素的混合物可用作液体培养基，亦可加入固化剂。“琼脂”是由海藻生产的天然多糖，是最常用来添加到培养基中的固化剂（最终浓度通常为1.5％w/v）。如果怀疑琼脂水解，则使用硅胶作为替代固化剂。
蛋白质水解物

复合培养基通常含有蛋白质水解产物，它们是生长培养基中极好的氨基酸、肽和蛋白质的天然来源。这是含氮营养素的最重要来源。它们通常通过酶消化或酸水解天然产物（例如动物组织、乳汁、植物或微生物培养物）获得。可用的蛋白质水解物（也称为蛋白胨）的数量是巨大的，并且可以促进和维持大多数常见生物的生长。对于酶消化，通常采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰液酶混合物。下面是常用的表达和定义。

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培地配制注意啥，拿出本本快记起。
现成配方有记载，不用设计最好地。
照搬照抄要注意，浓度单位换算齐。
体积是否每升起，质量摩尔百分比。
无机成分要注意，结晶水也占比列。
古典文献没有提，考据当初啥试剂。
有机成分要注意，浸膏浸粉不同比。
浸膏含水浸粉浓，同样重量可不依。
天然材料要注意，浸汁还是混悬剂。
浸汁必须要过滤，混悬粒度别忘记。
天然成分变化大，文献里面应有提。
试剂要看来源地，黑心商家发票齐。
前人成功好试剂，更换要做研究地。
成分平替要牢记，有效成分对标曲。
成分混合有顺序，颠倒次序出问题。
搅拌均匀是否滤，澄清培养分辨率。
混合均匀方差齐，不行请出均质机……困了，明天再更。