流式细胞术中荧光补偿调节和圈门策略 | 流式专栏（三）

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荧光补偿调节和“圈门”是流式细胞术数据处理的两大板块，前者能够解决荧光溢漏问题，是流式结果准确的基础；后者可通过前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）及表面荧光标志物来分辨和量化不同的细胞群，是流式数据分析的核心。
本文是【Proteintech流式专栏】第三期文章（点击文末目录即可查看往期专栏内容），将通过实例给大家详细介绍荧光补偿调节以及常规的圈门策略。

一. 荧光补偿调节

1、荧光补偿的定义

在进行荧光补偿调节之前，我们需要了解三个概念：荧光、激发光谱和发射光谱。
荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。光照射到某些原子上时会使一些电子由基态转变成激发态，但是激发态不稳定，最后还是会恢复到基态。当电子恢复成基态时，能量会以光的形式释放出来，因而产生荧光。
激发光谱是让不同波长的激发光激发荧光物质使其产生荧光，然后以激发光的波长为横坐标，荧光物质发出的荧光的强度为纵坐标所绘制的图谱。发射光谱是以荧光物质被激发后本身发出的荧光的波长为横坐标，荧光强度为纵坐标所绘制的图谱。
那什么是“补偿”呢？我们在流式实验中一般用的是偶联了荧光素的抗体，荧光素被激发后所发出来的光，其波长不是一个特定的值而是一个范围，当一种荧光素的信号能在另外一种荧光素对应的通道检测到时，就说明发生了荧光溢漏，溢出的这一部分信号就称之为补偿。在结果分析之前需要将这部分信号扣除，避免“假阳性”。

2、产生荧光补偿的原因

产生荧光补偿的原因主要有三种：
① 由同一激发光激发的荧光染料之间涉及补偿
荧光染料的发射光谱较宽，会出现光谱重叠的现象。例如下图中FITC和PE均可由488nm激光器激发，FITC的发射光经过525/40BP滤光片后被接收（绿色框），PE的发射光经过585/42BP滤光片后被接收（黄色框），可见黄色框内除了有PE的信号外还有少部分FITC的信号，这部分FITC通道溢漏到PE通道的信号就为“补偿”。



图1. FITC和PE光谱示意图（虚线为激发光谱、实线为发射光谱）

② 一些单体荧光素和偶联荧光素涉及补偿
这通常与偶联荧光素的激发原理相关，例如PE-Cy5和APC是由不同的激发光激发，但是两者之间却存在非常大的补偿。PE-Cy5这种偶联荧光素的激发过程是488nm的激发光先激发PE，PE发出575nm的荧光再激发Cy5，最终发射出670nm的荧光。但是PE-Cy5在一些条件下会解偶联成PE和Cy5，Cy5可以直接被633nm的激发光激发，其发射波长也是670nm。APC也可被633nm的激发光激发，发出670nm的荧光，因此会导致PE-Cy5和APC无法区分，这两种染料无法同时使用。一般偶联荧光素在甲醛固定和热刺激后容易解偶联。



图2. PE-Cy5偶联荧光素的激发机制

③ 发射光谱相近的荧光素涉及补偿
一些荧光素虽然由不同的激发光激发，但是也存在补偿问题。这是因为很多荧光素的发射光谱范围很宽。例如下图中的APC-Cy7和Percp-Cy5.5，这两种荧光素分别由637nm和488nm的激光器激发，但是存在较大的补偿。Percp-Cy5.5被激发后经过695/40BP滤光片后被接收（左框），APC-Cy7被激发后经过780/60BP滤光片后被接收（右框）。从图中可以看出两者的接收通道中都存在部分对方通道的信号，互有补偿。



图3. APC-Cy7和Percp-Cy5.5光谱示意图（虚线为激发光谱、实线为发射光谱）

在进行多色流式实验之前，大家一定要了解所用荧光染料的激发光谱和发射光谱（可通过Proteintech官网Spectra Viewer光谱查看器了解）（点击蓝字可直达），以及流式细胞仪激光器和检测通道的参数信息。因为不同的流式细胞仪其配置以及光路设计会有所差异，这种差异会使荧光素之间的补偿问题发生一些改变。

3、荧光补偿的调节

了解了“补偿”产生的原因之后，我们如何将这部分干扰信号给扣除掉呢？
在实验中设置单染管是关键。顾名思义，单染管就是只加一种荧光抗体的样本管。例如在一个实验中需要用到三种荧光抗体分别是APC、PE和FITC，那么我们需要设置6个样本管：



表1. APC、PE和FITC三色流式分析样本管设置

在制备单染管时有一些要求：
1）单染管和检测管的样本类型要保持一致。例如检测管用的是小鼠脾脏细胞，那么单染管也需要用小鼠脾脏细胞。2）用来制备单染管的抗体所偶联的荧光素必须与检测管的荧光素保持一致，并且要保证有明显的阳性信号。3）单染管和检测管的操作方式要保持一致。例如操作管进行了固定通透，那么单染管也需要固定通透。4）单染管上机时各个荧光通道的电压需要与检测管保持一致。
在上机过程中，我们可以直接在仪器上进行补偿调节，但是不同仪器的补偿调节模块不同，这里就不做详述。下面主要给大家介绍在FlowJo软件上用补偿矩阵进行补偿调节的方法。
① 将单染管文件拖入FlowJo“Compensation”一栏中。单染管文件命名没有要求，自己可以分辨即可；图4中两个文件命名分别为“Comp-APC-Cy7.fcs”和“Comp-APC.fcs”。



图4. 导入单染管文件数据

② 双击“Comp-APC.fcs”文件，根据FSC-A和SSC-A将目的细胞群圈出（图5左），然后通过FSC-A和FSC-H排除粘连体（图5中），之后选中“cells”和“Single Cells”这两级门拖到“All Samples”中，应用到所有样本管（图5右）。



图5. 圈出主细胞群并排除粘连体

③ 双击单染管名称前面的“九宫格”图标（图6左），出现补偿矩阵页面（图6右）。



图6. 展开补偿矩阵界面

④ 可通过点击每个通道前面的蓝色框对钩（图7左），将实验没有涉及到的通道隐藏起来，只留下需要调节补偿的通道。如下图中只留下APC和APC-Cy7两个通道（图7右），便于后续分析。



图7. 隐藏无关通道信息

⑤ 在“Preview Sample”一栏中前面选择所需调节的单染管名称，后面选择“cells/Single Cells”（图8）；可以看出APC单染管中的细胞群并非垂直状态，而是向右（APC-Cy7通道）倾斜，说明有部分APC信号溢漏到APC-Cy7通道里（纵坐标代表APC通道信号，横坐标代表APC-Cy7通道信号）。



图8. 明确荧光溢漏情况

⑥ 明确荧光溢漏情况后，在黑色箭头所示小框内填入需要扣除的荧光值（图9），通过扣除前后细胞群的位置变化来调整所填荧光值的大小，直至将细胞群调整至横平竖直的状态。当在小框内填20时，可见细胞群仍然是歪斜状态（图9左，图中蓝色细胞群为调整前的细胞，黑色为调整后的细胞），说明20偏小；后改为26（图9右），细胞群处于横平竖直状态，说明补偿调节完成。
注意：如果A通道信号溢漏到B通道，那么我们就需要选择B为横坐标，A为纵坐标的小框内填写荧光补偿值。



图9. 调整荧光扣除参数

⑦ 补偿调整结束后，点击“M”不动，将其拖拽到“All Samples”应用到所有样本管（图10），所有样本管前面九宫格颜色与黑色箭头所示的颜色保持一致表示应用成功。



图10. 补偿调节应用至所有样本

⑧ 对比检测管中APC-Cy7和APC调整前后的双参数散点图，证实补偿调节使细胞群处于正确的位置（图11）。



图11. 补偿调节前后双参数图对比

到这里在FlowJo软件上用补偿矩阵调节补偿的流程就结束了。
需要注意的是，有时会出现样本管的文件拖到FlowJo后，前面没有出现九宫格，而是显示白色方格的情况。这是因为在上机时没有进行补偿调节，没有补偿文件，这个时候我们只要新建一个补偿文件就可以解决。流程如下，后续操作与上述补偿调节过程相同。



图12. 新建补偿文件

二. 圈门策略

在补偿调节结束后，流式数据的分析需要进行一系列的门控操作，也就是我们俗称的“圈门”，这个过程非常灵活，没有标准化的操作指南，主要依靠我们前期对细胞表型特点的认知和经验。下面用实例来给大家介绍整个“圈门”的过程和其中的逻辑。
以人PBMCs中单核细胞的基础流式分析为例：
首先我们需要了解细胞哪些标志物是共表达、哪些标志物是互斥表达、以及标志物之间的上下游关系。
单核细胞是体积最大的白细胞，是机体防御系统的一个重要组成成分。HLA-DR是人Ⅱ类主要组织复合物抗原，在抗原递呈细胞如B淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞上广泛表达。单核细胞高表达HLA-DR，但是不表达T淋巴细胞的标志物CD3。单核细胞的固有标志物是CD14，我们可以通过CD14和CD16这两种标志物将单核细胞分为三个不同的亚群：经典型（CD14bightCD16-）、中间型（CD14+CD16+）、非经典型（CD14dimCD16+）。在正常的人外周血中，CD64在经典型单核细胞上高表达，其是一种高亲和力的Fc gammaⅠ型受体，是感染性疾病的感染指标。
不同类型的单核细胞具有不同的功能，经典型单核细胞具有更高水平的吞噬活性，中间型单核细胞具有炎症特性，非经典型单核细胞具有抗炎特性，因此通过单核细胞的基础亚群分析，可以大致了解机体的免疫状态。



图13. 单核细胞的流式分析策略

了解了单核细胞的表型特点后，我们可以开始进行“圈门”操作：
① 根据FSC-A和SSC-A将单核细胞群圈出。单核细胞的细胞大小以及细胞内复杂程度都要高于淋巴细胞，因此单核细胞群位于淋巴细胞群上方（图14左）。
② 根据FSC-H和FSC-A排除粘连体，正常单个细胞的H和A成比例增大，粘连体通过时，H不变，A增大（图14中）。
③ 通过死活细胞染料区分死活细胞。死细胞容易非特异性结合抗体或染料，会影响实验结果准确性，需使用一些染料来标记并排除死细胞。死细胞的细胞膜是不完整的，染料可以直接穿过细胞膜，结合核酸后发出荧光或者结合因细胞凋亡导致细胞膜上外翻的磷脂酰丝氨酸后发出荧光，所以圈门时要选择阴性细胞群，即为活细胞群（图14右）。



图14. 主细胞群、单个细胞以及活细胞圈门

④ 在主细胞群中圈出非粘连体状态的活细胞之后，我们需要根据HLA-DR和CD3这两种互斥表达的标志物来初步确定单核细胞。先分别用HLA-DR FMO样本管和CD3 FMO样本管确定HLA-DR和CD3阴阳性细胞的分界线，再应用到检测管，得到HLA-DR和CD3双参数散点图。圈出HLA-DR+CD3-细胞群进行下一步圈门。
FMO对照（Fluorescence Minus One，荧光扣除一）：是在流式染色时减少一个通道的荧光抗体。例如此例中HLA-DR FMO样本管就是里面加入了CD3、CD14、CD16、CD64以及死活染料却没有加HLA-DR抗体的样本管。一般在多色实验中会设置FMO对照样本管，这样有助于精确的设置细胞阴阳群的界限，防止其他通道的干扰，使实验结果更精确。



图15. HLA-DR+CD3-细胞群圈门

⑤ 圈出HLA-DR+CD3-细胞群之后，进一步我们需要确定经典型单核、中间型单核和非经典型单核细胞群。先分别用CD14 FMO样本管和CD16 FMO样本管画十字门确定CD14和CD16阴阳性细胞的分界线，再应用到检测管，得到CD14和CD16双参数散点图。左上为经典型单核细胞（CD14bightCD16-）、右上的上部分为中间型单核细胞（CD14+CD16+），右上下部分为非经典型单核细胞（CD14dimCD16+）。



图16. CD14和CD16圈门区分经典型、中间型及非经典型单核细胞

⑥ 通过CD14和CD16圈门区分三种类型的单核细胞之后，我们还可以进一步观察三种类型单核细胞上CD64的表达情况，从直方图中可见，经典单核细胞群中高表达CD64。



图17. 三种单核细胞上CD64的表达情况

最后给大家梳理一下圈门的基本流程：圈出主细胞群（FSC-A & SSC-A）；圈出单细胞群（FSC-A & FSC-H）；圈出活细胞群；根据目的细胞上表达的泛标志物圈出目的细胞群；根据目的细胞分型标志物将其不同亚型区分开来。



图18. 单核细胞的基础流式圈门策略

单核细胞的基础流式圈门策略全部内容全到这里就结束啦，下表是上述实验所用的抗体及细胞死活染料组合，有需要的老师可以参考一下。



表2. 单核细胞基础流式分析试剂组合

好啦，以上就是今天要和大家分享的第三期流式专栏内容——流式细胞术中荧光补偿调节和圈门策略，感谢大家的阅读和聆听，后续专栏我们计划分享一些流式实验protocol和多色流式配色方案，敬请期待~

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