NC | 史上最强基因编辑预测神器诞生！EVA评分预测准确度高达83%！

检验之星

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基因编辑就像用分子剪刀在DNA上进行精确手术，而gRNA（向导RNA）就是这把剪刀的"GPS导航系统"。然而，长期以来，科学家们一直面临一个难题：如何准确预测哪些gRNA能够高效工作？
近日，德国马克斯·普朗克进化人类学研究所的Stephan Riesenberg研究团队在《Nature Communications》上发表了一项重磅研究：“Robust prediction of synthetic gRNA activity and cryptic DNA repair by disentangling cellular CRISPR cleavage outcomes”，他们开发出了迄今为止最准确的合成gRNA活性预测模型——EVA评分系统，为精准基因编辑带来了革命性突破。


传统评估方法存在严重盲区
过去，科学家们主要通过检测短插入缺失（indels）来评估gRNA效率，就像只看手术刀是否留下了伤口来判断手术是否成功。但研究团队发现，这种方法存在严重盲区。
通过对78个gRNA的全面筛选，研究者发现了一个惊人现象：仅用indels评估时，平均gRNA活性为59%，但当综合考虑细胞死亡、完美修复、大规模修复等所有结局后，高达93%的gRNA实际活性都在40%以上（Figure 1）。
这意味着传统方法严重低估了gRNA的真实活性！研究团队形象地将这些被忽视的修复事件称为"隐秘修复"。



Figure 1

EVA评分：基因编辑界的"GPS导航"
研究团队通过深入分析，识别出影响合成gRNA活性的5个关键特征：

• gRNA序列的自由能
  
• GA二核苷酸数量
  
• MIT脱靶评分
  
• 切割位点核苷酸组成
  
• PAM邻近核苷酸组成
  

基于这些特征，团队开发了EVA活性评分系统。在验证实验中，EVA评分与实测gRNA活性的相关性高达0.83（Figure 2b），这一精度已经接近生物学重复实验之间的相关性（0.95）。
更令人兴奋的是，EVA评分在未参与训练的40个新gRNA上的预测准确度仍达到0.74（Figure 2d），证明了模型的强大泛化能力。



Figure 2

颠覆性发现：合成gRNA远优于转录gRNA
他们选取了此前研究中表现最差的4个gRNA（在转录形式下效率几乎为0），用合成gRNA重新测试。结果令人震惊：这些在合成形式下的活性竟然达到79-96%，平均提升了31倍！（Figure 3c、d）
这一发现彻底颠覆了人们的认知：问题不在gRNA本身，而在于转录过程中的各种偏差。



Figure 3

HDR效率预测：精准编辑的又一利器
除了gRNA活性预测，研究团队还开发了同源定向修复（HDR）效率预测工具。他们发现：

• HDR效率与DNA供体的自由能密切相关（相关性0.57）
  
• 胸腺嘧啶到胞嘧啶的转换效率比鸟嘌呤到腺嘌呤高出2.5倍以上
  
• 距离切割位点仅5个核苷酸，HDR效率就会下降一半
  

这些发现为精确的点突变编辑提供了重要指导。
Cas9 vs Cas12a：安全性的重大差异
研究还揭示了Cas9和Cas12a在安全性上的重要差异。通过NHEJ抑制剂比较筛选，研究团队发现：

• 49%的Cas9 gRNA倾向于产生大规模修复事件（如染色体缺失、易位等）
  
• 而所有测试的Cas12a gRNA都倾向于完美修复，极少产生大规模修复
  

这一发现对基因治疗的安全性具有重大意义。研究者推测，Cas12a产生的粘性末端相比Cas9的平末端，能显著降低不良修复事件的风险。
实用工具：一键查询基因组gRNA评分
为了让这一成果真正惠及科研社区，研究团队为人类和小鼠基因组的所有gRNA预计算了EVA评分，并提供了UCSC基因组浏览器在线查询工具（Figure 2e）。
Human：https://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&hubUrl=https://bioinf.eva.mpg.de/pub/EVA_USCS_tracks/hub.txt)
Mouse：https://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=mm39&hubUrl=https://bioinf.eva.mpg.de/pub/EVA_USCS_tracks/hub.txt
他们发现在4140个疾病相关位点中，有4105个位点可以用高效的合成gRNA进行编辑，而这些位点用传统转录gRNA很难有效编辑。
这项研究不仅为基因编辑提供了迄今最准确的gRNA预测工具，更重要的是改变了我们对基因编辑结局的认知。EVA评分系统就像为基因编辑装上了精准的"GPS导航"，让科学家们能够更好地选择编辑工具，提高实验成功率，并为未来的基因治疗提供更安全的方案。
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