PCR实验超详细指导：改进确保PCR成功和保持一致性的15种方法

wolf

一、前言

我们已通过过往文章：
1.实验笔记：5000字PCR笔记+96页PCR进阶PDF，让PCR变得简单
2.DNA提取与扩增系列（二）：PCR体系建立与完善（5000+字全面介绍）
了解了PCR的原理、步骤、用途和PCR实验室体系完善等。
作为一名工作涉及生命科学的研究人员，如果在研究中经常使用PCR，尽早解决初期问题可以节省大量麻烦。自1988年热稳定Taq DNA聚合酶商业化以来，基于 PCR的方法和应用的数量出现了令人难以置信的增长。虽然许多这些PCR变体（有可能最全的PCR类型总结：36种PCR类型及其定义、原理和用途）需要特定的试剂、硬件和/或数据分析方法，但仍然可以遵循几条基本规则，以确保PCR实验每次都能产生相同的结果！
二、确保成功和一致性的方法（1~4）

1.了解并正确地选择PCR类型

PCR有两种主要类型——终点PCR和定量PCR（qPCR）。终点PCR仅在PCR完成后测量积累的产物，而qPCR在反应的指数阶段实时定量产物。这些类型有很多种变化，包括数字PCR、巢式PCR、长片段PCR和定量逆转录PCR等。
最好完全了解目前的实验需求，适合使用哪种方法，因为每种方法都有自己的优点和缺点、它们更适合的应用以及需要优化的特定参数。从长远来看，在开始 PCR实验之前进行一些背景阅读可以节省大量时间和不必要的麻烦。
2.预混

预混是保持PCR每个孔之间一致性的根本方式。PCR预混通常包含Taq DNA聚合酶、四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、MgCl2（镁离子）和PCR缓冲液等，这些都是PCR反应所需的关键成分。
使用PCR预混液可以省去单独配制各种组分的繁琐过程，大大简化了实验流程。此外，预混的PCR mix经过了严格的质量控制，可以确保每次反应的一致性和准确性。由于减少了操作步骤，PCR预混液降低了样本受到污染的可能性。
PCR预混液可以让研究人员只需一次加样，即可启动PCR反应，简化了实验操作流程。提供高效的PCR反应，同时保持反应的稳定性。
根据个人总结的经验，在放入热循环仪之前，最好将加样完成的管或板再涡旋混合以下，因为试剂可能会沉降和混合，避免不同管或孔之间试剂分布不均匀。
3.使用正确数量的引物、模板和其他试剂

引物浓度在0.1到0.6μM之间通常就足够了。引物浓度过高会导致引物二聚体和非特异性产物的产生，而引物浓度过低会导致产物产量降低。对于每个新的引物对，最好都应该摸索合适的浓度配比。此外，如果希望储存稀释的引物工作储备液，则应将其制备在特定的低DNA结合管中，以防止引物浓度随时间推移而显著下降。
反应中模板的量对PCR性能有显著影响。哺乳动物基因组DNA的PCR通常最多使用 500ng，细菌DNA最多使用1-10ng，质粒DNA最多使用0.1-1ng。如果模板浓度低是不可避免的，应相应地调整PCR方案。然而，对于qPCR，较低的模板浓度可以提高准确性。将模板进行梯度稀释可以确定最高PCR效率的浓度范围。如果担心模板溶液中存在PCR抑制剂（例如乙醇和DMSO）并影响PCR性能，模板稀释将有助于减轻其影响。
DNA聚合酶浓度应介于每50 μL反应体积0.5至2.5单位之间。酶浓度过高会降低PCR 特异性。
PCR的最佳Mg2+浓度可在1–5 mM之间。1.5 mM的Mg2+浓度通常与浓度为200 μM的dNTP一起使用。过少的Mg2+会降低PCR产量，而过量的Mg2+会导致复制错误和非特异性产物。为了保证实验顺利，最好检查反应缓冲液是否已经含有Mg2+。
四种dNTP应以每种50–500 μM的等比浓度提供，以最大限度地降低聚合酶错误率。请注意，由于dNTP会螯合Mg2+，因此较高的dNTP浓度需要增加Mg2+浓度。通常使用每种200 μM的dNTP浓度。
4.避免引物降解

引物降解会降低PCR效率和灵敏度。当使用冻干引物时，将其重悬于中性缓冲液（例如 10 mM Tris-EDTA，pH 7.5）中，而不是水，以获得更好的水解长期稳定性。应将重悬的引物主储备液（100–200 mM）分装成更小的体积，以避免在−20°C下多次冻融循环降解。 然后，可以在相同的缓冲液中制备工作储备液（10–20 mM），其体积最多允许三个冻融循环。请注意，太稀的DNA溶液在任何储存条件下都不太稳定。
三、确保成功和一致性的方法（5~8）

5.注意分液错误和蒸发

分装小体积时，请始终使用小容量移液器（即不要使用200 μL移液器移液2 μL），这将提高对移液的准确性是个考验。尽可能制备反应预混液，因为这可以减轻测量小体积时移液错误的影响，尤其是含有甘油的酶储备液。
6.将RNA样品和酶保存在冰上

在进行PCR实验时，最好将含有逆转录酶和聚合酶的RNA样品和试管保存在冰上。这是为了防止RNA和酶降解。此外，应最后添加聚合酶，然后应立即将反应转移到热循环仪中，因为聚合酶将立即开始工作，并且在较低温度下可能会发生误引发。
7.杜绝PCR污染

PCR 的强大之处在于它能够扩增单个DNA分子。这里也存在危险——即使是微量的 DNA也可以作为反应的模板。这种污染的DNA会与模板竞争试剂，并产生不需要的产物，从而影响结果。以下是一些有助于解决此特定问题的提示：

• 核酸提取和模板添加、预混液制备/等分试剂、扩增和PCR后分析均采用单独的工作区域。每个工作区域都应有自己的一套无核酸酶水、通用缓冲液、实验室外套、手套、移液器组、涡流、离心机和吸头。
  
• 使用前后对工作区域进行适当的净化。
  
• 尽可能使用带滤芯的吸头，并确保它们与移液器正确匹配。
  
• 如果不使用带滤芯的吸头，请小心移液器中产生的气溶胶。
  
• 在每个等分步骤后更换移液器吸头（特别小心引物或模板交叉污染）。
  
• 先分装试剂，然后再分装模板。
  
• 戴上手套，注意接触的表面，并经常更换手套。
  
• 每次打开管前短暂旋转管，以避免在打开试管盖时气溶胶转移到手套和工作区域。
  
• 将试剂储备液分装成更小的1到3次使用体积，以减少冻融和实验之间潜在的污染（每个研究人员都应有自己的储备液）。
  
• 对管进行标记，并记录每个实验中使用的储备管。
  
• 始终使用无菌实验室器皿、水和缓冲液，并对所有可以安全高压灭菌的实验耗材进行高压灭菌。
  
• 始终包括阴性对照（无模板）和阳性对照（以前运行良好的模板）。
  

8.规范耗材和设备

虽然当存在重现性问题时，反应组分或PCR条件问题是常见的问题，但有时实验室器具或设备可能会带来问题。

• 使用专为PCR设计的薄壁反应管，与使用的热循环仪的孔精确匹配。从加热块到反应的热传递变化会影响结果的一致性。
  
• 确保热循环仪由经过认证的技术人员定期维修。热循环仪必须能够准确地循环完成PCR步骤并可重现地保持设定温度。
  
• 定期对移液器进行专业清洁和校准，以避免系统性的移液错误。
  

四、确保成功和一致性的方法（9~12）

9.模板质量

模板纯度会对PCR结果产生重大影响。例如：

• 苯酚、蛋白酶、尿素和去污剂等聚合酶抑制剂的存在会降低PCR效率。
  
• DNA提取后残留的大量RNA会螯合Mg2+并降低扩增产量，而RNA提取后残留的基因组DNA会导致脱靶扩增。
  
• 当然，模板完整性也是关键。降解的模板会导致条带拖尾和不准确的定量。
  

这在使用RNA模板时尤为重要，因为RNase在环境中无处不在，并且在细胞裂解过程中释放到样品中的数量很高——对于RNA模板，应在裂解过程中将RNase抑制剂添加到样品中，并且实验室器皿和工作区域需要使用RNase灭活试剂进行去污。还应该使用不含DNase和RNase的试管，并且应避免过多的冻融循环。可以使用各种方法检查模板质量。
10.引物质量

对于大多数实验室来说，引物合成是外包的，质量受到严格控制。但是，如果引物设计不当，可能会出现许多问题。对于如何设计引物，可参考《如何设计引物》。对于 RT-PCR，需要根据应用在oligo（dT）引物、随机六核苷酸或特异性引物之间进行选择。
11.聚合酶的选择

DNA聚合酶的选择会显著影响PCR性能，RT-PCR的逆转录酶选择也会显著影响PCR 性能。对于常规PCR，Taq DNA聚合酶长期以来一直是金标准。但是，对于某些应用，可能有更适合的聚合酶。例如，在模板GC含量高的情况下，可承受较高温度的逆转录酶会有所帮助，并且需要避免形成二级结构和错误引发的可能性。其他示例包括克隆、突变分析和测序，其中需要具有高校对能力的高保真聚合酶。
12.缓冲盐和pH条件

反应中NaCl和KCl浓度过高（>50 mM）和次优pH条件（pH超出8.0–9.5的范围）会抑制PCR。通常可以依靠聚合酶随附的反应缓冲液的盐浓度和pH值来指导确定PCR反应的理想条件。但是在某些情况，可能要调整调整盐和pH值来提高PCR性能。
五、确保成功和一致性的方法（13~15）

13.反应助剂
在某些情况下，某些添加剂可以提高PCR效率和特异性，这些添加剂包括牛血清白蛋白、DMSO、甘油、某些去污剂和甲酰胺等。需要通过反复试验来确定最佳添加剂。
14.PCR循环条件

PCR变性步骤的温度必须足够高以实现模板的完全链分离，引物退火步骤的温度必须足够高以防止错误引发，并且延伸步骤的温度必须最适合聚合酶。每个步骤的孵育时间、温度升温速率、 PCR循环数也会影响PCR。
15.通过内标归一化

通过在PCR中加入内标，以控制PCR效率并协助数据归一化。例如，可以包含对“管家”基因（即，在被比较样品中应具有恒定表达的组成型表达基因）特异性的第二个引物对。
<hr/>参考文献：
1.Saiki R, Gelfand D, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487. doi:10.1126/science.239.4839.487.
2. Nolan T, Huggett J, Sanchez E, Sanders R, Redshaw N, Wilkes T. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (QPCR).2013. doi:10.13140/RG.2.2.15943.96162. Accessed November 26, 2020.
3. Optimising PCR. European Molecular Biology Laboratory (EMBL). https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/ cloning/pcr_strategy/optimising_pcr/index.html. Accessed November 26, 2020.
4. Article 3: qPCR assay design. European Pharmaceutical Review. https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/ article/846/article-3-qpcr-assay-design/. Published May 29, 2009. Accessed November 30, 2020.
5. Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 2012;(63):e3998. doi:10.3791/3998
6. Do’s and don’ts for molecular testing. Global Malaria Programme, World Health Organization. https://www.who.int/ teams/global-malaria-programme/case-management/diagnosis/nucleic-acid-amplification-based-diagnostics/dos and-don-ts-for-molecular-testing. Updated January 31, 2018. Accessed November 26, 2020.
7. Primer design. European Molecular Biology Laboratory (EMBL). https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/ cloning/pcr_strategy/primer_design/index.html. Accessed November 26, 2020.
8. Bustin S, Huggett J. qPCR primer design revisited. Biomol Detect Quantif. 2017;14:19-28. doi:10.1016/j. bdq.2017.11.00


原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/1921949425992966723