科研干货！一文搞懂细胞免疫荧光技术

青草

免疫荧光技术，融合了免疫学、生物化学与显微镜技术的精髓，是一项创新的技术手段。它基于抗原抗体特异性结合的原理，将已知的抗原或抗体标记上荧光染料，再利用这种荧光标记的抗体（或抗原）作为检测工具，检查细胞或组织中的相应抗原（或抗体）。借助荧光显微镜，我们能够观察到荧光信号所在的细胞或组织，从而揭示抗原或抗体的特性与位置，并通过定量技术（如流式细胞术）测定其含量。

一、实验准备

  1. 胰蛋白酶
  2. BI细胞培养液图像
  3. BI血清
  4. 细胞培养12孔或6孔板
  5. 爬片

二、实验操作步骤

1. 细胞铺板与爬片制备：荧光显微镜直接拍摄培养皿中的细胞并无太大难度，但制备爬片效果更佳，既提升成像质量，又便于共聚焦拍摄，且可冷冻保存以备后用。爬片预处理需涂布多聚赖氨酸以增强细胞附着性。

（1）将多聚赖氨酸均匀涂布于爬片上，静置30至120分钟。

（2）随后用无菌超纯水清洗并浸泡。

（3）自然干燥后，置于紫外线下照射至少1小时。若爬片已高温灭菌，照射时间可适当缩短。

（4）若使用普通盖玻片而非专用细胞爬片，建议先用0.1% Tween-20的PBS清洗，以去除杂质。

（5）在培养皿中滴加约100微升培养液，然后将爬片贴上，确保贴合紧密且无气泡。

（6）进行常规细胞培养。若细胞贴壁能力强，如胰蛋白酶消化需3分钟以上，则可省略第一步。

2. 细胞固定与免疫荧光染色
（1）吸去培养液，用PBS清洗细胞3次，每次5分钟。

（2）加入1毫升4%多聚甲醛，室温固定20分钟。

（3）吸去多聚甲醛，用PBS清洗3次，每次5分钟。

（4）加入0.5% Triton X-100（PBS配制），室温通透20分钟，以增加细胞通透性。

（5）吸去Triton X-100，用PBS清洗3次，每次5分钟。

（6）用10%与二抗同源的山羊血清（PBS配制）或5% BSA封闭2小时。封闭液应与后续抗体稀释液一致。封闭后无需用PBS清洗。

（7）吸去封闭液，向每孔加入足量适当浓度的一抗（首次使用抗体可参考抗体说明书推荐浓度，后续实验可根据实际情况调整），置于4℃湿盒内孵育过夜。

（8）吸去一抗，用PBS清洗3次，每次5分钟。

（9）向每孔加入足量适当浓度的二抗，37℃室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光标记，操作过程应尽量在暗处进行。

（10）吸去二抗，用PBS清洗3次，每次5分钟。

（11）向玻片上滴加DAPI或Hoechst染液复染细胞核，一般呈现蓝色荧光；避光孵育5至10分钟。图像

（12）用PBS轻轻清洗细胞3次，每次5分钟，以去除多余的DAPI。

（13）取爬片时，由于爬片与培养皿底结合紧密，张力较大，可用注射器针头针尖在背面做一个小钩，轻轻勾起爬片，再用小镊子取出。

（14）用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。注意将爬片反转贴于多聚赖氨酸载玻片上，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。需根据抗体选择相应的激发光源。

三、操作注意事项

  1. 取细胞爬片时，动作需轻柔，以免夹碎爬片，影响实验进度。

  2. 在种细胞过程中，应轻柔混匀细胞，以“八”字或“十”字形摇晃，避免细胞局部过密。

  3. 在稀释、加入二抗（荧光抗体）及后续洗涤过程中，需注意避光。

  4. 细胞爬片进行免疫荧光染色后，应尽快拍照，以免免疫荧光淬灭。或置于暗盒内，暂时保存于4℃冰箱，并尽快完成拍照。

  5. 在使用荧光显微镜拍照时，需根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI可将凋亡和未凋亡的细胞均染成红色/蓝色，而仅在凋亡细胞核中有FITC-12-dUTP掺入并呈现绿色荧光。

四、总结

要获得一张完美的免疫细胞荧光图像，从爬片制备、固定液选择、通透方式到抗体浓度的确定，每一个环节都至关重要。无论哪种实验，都需要通过反复熟悉实验步骤和优化条件，才能最终取得理想的实验结果。

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