慢病毒转染贴壁细胞实验方法

生物科研实验室

1.细胞准备：

在慢病毒转染前18-24小时，将状态良好的贴壁细胞以2×10^5/孔的密度均匀铺至6孔板中。确保在转染时，细胞数量达到约4×10^5/孔，且细胞融合度适中（一般为30%-50%），以保证细胞在转染过程中的活力和转染效率。



2.病毒孵育：

转染当天，吸去原培养基，加入2 mL含有0.5 μg/mL Polybrene的新鲜培养基。Polybrene能够中和细胞表面的负电荷，减少病毒颗粒与细胞之间的静电排斥，从而显著提高慢病毒的感染效率。

根据所需的感染复数（MOI），加入适量的病毒悬液。轻轻摇晃6孔板，使病毒液与培养基充分混匀。将6孔板置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育，让病毒与细胞充分接触并开始感染过程。



3.Polybrene稀释（可选步骤）：

孵育4小时后，对于对Polybrene毒性较为敏感的细胞，可以加入2 mL新鲜培养基，以稀释Polybrene的浓度，降低其对细胞的毒性影响，从而减少细胞死亡，提高转染效率。



4.换液：

继续培养24小时后，吸去含有病毒的培养基，加入新鲜培养基。换液可以去除残留的病毒颗粒和可能的毒性物质，为细胞提供新的营养物质，促进细胞的生长和病毒基因的表达。



5.观察与检测：

①荧光观察：如果慢病毒载体携带荧光蛋白基因，一般在转染48小时后，通过荧光显微镜可以观察到明显的荧光表达，72小时后荧光强度会更加显著。此时，可以初步评估转染效率，并通过拍照记录结果。

②FACS检测：为了更准确地定量分析转染效率，可以在转染后72-96小时，使用流式细胞仪（FACS）对细胞进行检测。通过分析荧光阳性细胞的比例，得出精确的转染效率数据。

③药物筛选：如果慢病毒载体含有抗性基因，如嘌呤霉素抗性基因，可以在转染3-4天后，向培养基中加入相应的药物进行筛选。筛选期间，定期观察细胞的生长状况，及时更换新鲜的含药培养基，直至获得稳定转染的细胞株。