从参考体系出发 说说“定性” “半定量” “相对定量” “绝对定量”

yunchu1991

我经常在做实验的间隙思考一些问题，比如各种类型的检测之间的联系和差异。有一天参考体系突然闯入脑子，我发现这个概念可以将各种类型的检测联系起来。于是就有了这篇文章。

在生物医学研究的实验室里，我们每天都在进行各种“测量”。从判断一份样本是否含有病毒，到精确计算某个基因的拷贝数，这些检测任务看似千差万别，但其核心逻辑都可以通过一个关键概念来理解——参考体系。

参考体系，即测量中所依据的基准、标准或尺度。它决定了检测结果的形态、精度和最终解读方式。本文我想从从参考体系的视角切入，层层剖析定性、半定量、相对定量与绝对定量这四类检测方法的根本区别，揭示其背后的科学逻辑与应用场景。

一、 定性检测：参考体系是一道“是非线”

1. 核心问题与参考体系

定性检测的核心问题：“有，还是没有？”（是否存在？是否为阳性？）

参考体系：一个预设的、二元化的阈值（Cut-off值）。这道“是非线”是判断的唯一标准，其本身不提供任何程度信息。

2. 工作原理

定性检测的本质是比较-判断。将样本产生的信号（如试纸条T线的颜色深度、PCR的Ct值）与预设的阈值进行比较：

信号 ≥ 阈值 → 阳性（有）

信号 < 阈值 → 阴性（无）

3. 典型技术与案例

技术：免疫层析试纸条（如早孕试纸、COVID-19抗原检测）、普通PCR扩增后电泳看有无条带。

案例：COVID-19抗原检测。试纸条上的C线是过程对照，T线本身就是那道物理世界的“是非线”。样本滴入后，只要T线显色达到或超过肉眼可辨的阈值，即判为阳性。它只告诉你“感染了”，但无法告知病毒载量高低。

4. 特点总结

其参考体系是一道静态的、用于二元判决的界限。它简单、快速、成本低，但信息量极少，无法满足深入分析的需求。

二、 半定量检测：参考体系是一把“粗糙的刻度尺”

1. 核心问题与参考体系

核心问题：“多，还是少？”（强度如何？大致水平？）

参考体系：一个不连续的、分级的强度标度（如：-、+、++、+++）。这把“尺子”只有粗略的刻度，只能进行等级判断，无法精确读数。

2. 工作原理

半定量检测在定性基础上前进了一步，在终点对信号强度进行大致评估。它通常没有严格的数学换算关系，依赖于对比和估算。

通过比较目标信号与内参信号的强度比例（如灰度值），大致估算目标物的丰度范围。

由于检测已进入平台期，信号与起始量之间不再是线性关系，因此估算极其粗略。

3. 典型技术与案例

技术：Western Blot（蛋白质免疫印迹）、普通PCR后电泳结合凝胶成像分析。

案例：Western Blot检测某蛋白表达。实验员会通过内参蛋白（如β-actin）来证明上样量一致，然后通过目标条带的深浅判断：“处理组的条带比对照组深很多（+++ vs +）”。但没人会声称“表达量是3倍”，因为条带亮度与蛋白浓度并非严格的线性关系。

4. 特点总结

其参考体系是一把粗略的、用于分级的标尺。它提供了比定性检测更多的信息，可用于快速筛选和趋势判断，但结果主观性强、精度低、无法进行严格的统计学比较。

三、 相对定量：参考体系是一把“标准的比例尺”

1. 核心问题与参考体系

核心问题：“A相对于B，变化了多少倍？”

参考体系：一个双重的、动态的校准系统。

内参基因/蛋白：用于校正样本间的差异（如细胞数量、RNA质量、上样误差）。这是“内部标准”。

对照组/校准样本：作为所有比较的生物学基线（如未处理的细胞、0时间点）。这是“外部基准”。

2. 工作原理

相对定量的精髓在于校准-换算。其过程是一个严谨的数学流程，以qPCR的△△Ct法为例：

样本内校准：△Ct = Ct(目标基因) - Ct(内参基因) → 消除样本间差异。

组间校准：△△Ct = △Ct(实验组) - △Ct(对照组平均) → 建立与基线的差异。

数学换算：Fold Change = 2^(-△△Ct) → 将对数级的Ct差转换为线性级的倍数变化。

3. 典型技术与案例

技术：实时荧光定量PCR（qPCR）。

案例：研究药物对某基因表达的影响。最终结果会报告：“经药物处理后，目标基因的表达量相对于对照组显著上调了4.5倍（p < 0.05）”。这个“4.5倍”是一个无量纲的比值，其准确性高度依赖于内参基因的稳定性。

4. 特点总结

其参考体系是一个复杂的、用于比例换算的系统。它输出的是连续的、精确的、可进行统计学检验的比值，完美回答了生物学中“变化多少”的核心问题，是功能学研究的主流方法。

四、 绝对定量：参考体系是一台“精密的天平”

1. 核心问题与参考体系

核心问题：“绝对量是多少？”（浓度几何？拷贝数多少？）

参考体系：一系列已知绝对量值的标准品所构建的标准曲线。这台“天平”必须经过已知重量的“砝码”校准，才能称出未知样本的重量。

2. 工作原理

绝对定量的核心是标准曲线拟合。

建立标准：将一系列浓度已知且梯次递增的标准品与样本同时检测，得到其信号值（如Ct值）。

绘制曲线：以标准品浓度的对数值为X轴，以其信号值（如Ct值）为Y轴，绘制标准曲线，得到拟合方程 Y = a*log(X) + b。

计算未知：将未知样本的信号值代入方程，反推出其绝对浓度。

3. 典型技术与案例

技术：数字PCR（dPCR）、基于标准曲线的qPCR。

案例：AAV病毒载体滴度测定。实验中使用包含 10^2 - 10^8 copies/μL 的基因组标准品建立标准曲线。将未知样本的Ct值代入曲线，即可直接计算出其浓度。这个结果不依赖于任何对照组或内参，是一个有单位的、绝对的量值，所以说绝对定量的目标是赋值。

4. 特点总结

其参考体系是一条经过严格校准的、用于绝对赋值的曲线。它输出的是有单位的、绝对的物理量，是诊断、病毒载量监测、代谢物浓度测定等领域的金标准。

五、 总结

这四种检测类型的参考体系，构成了一个从简单判断到精确测量的完整光谱。

对于实验设计者：应根据科学问题选择正确的方法。若需比较变化，相对定量是黄金标准；若需诊断临界值，则必须使用绝对定量。

对于数据解读者：应能洞察数据背后的参考体系。看到一个“4.5倍”的结果，应立刻想到其依赖于内参和对照组的选择；看到一个“10 ng/mL”的结果，则应关注其标准曲线的质量（R²值、效率）。

总之，参考体系是隐藏在检测数据背后的“哲学”。从一道简单的线，到一条复杂的曲线，参考体系的演变，体现了人类对生命现象从定性认识到精确测量的科学征程。选择正确的参考体系，就是选择了一把正确的尺子，才能丈量出真实的生物学世界。