导语：高通量测序（NGS）技术为临床感染性疾病提供了高通量检测技术手段，主要包括宏基因组高通量测序（mNGS）、病原靶向高通量测序（tNGS）和全基因组测序（WGS）。 tNGS和mNGS通量高，可一次性检测百种以上病原。两者不同之处在于，mNGS为鸟枪法测序，无需预设待检病原，但易受人源背景干扰。而tNGS通过特异性引物扩增或者杂交捕获的方式靶向富集目标病原体或基因，测序量仅为mNGS百分之一，成本低且同一流程可检测DNA和RNA病原。tNGS按照技术路线可分为多重PCR扩增法和探针捕获法。 近日，由中国食品药品检定研究院联合多家单位共同完成的《病原靶向高通量测序技术质量评价联合研究》[1] 结果正式发布。 这项研究旨在全面评估我国病原靶向高通量测序（tNGS）试剂的性能现状，梳理质量控制要点，为推动该技术的规范发展提供科学依据。 tNGS/mNGS的临床应用场景选择 在临床感染诊断的赛道上，病原宏基因组高通量测序（mNGS）技术在急危重症感染及不明原因发热的诊断领域取得显著成绩。而tNGS技术，凭借结果清晰和成本效益等优势，正迅速获得临床大量关注。 tNGS技术专注于已知病原体，同时兼顾DNA和RNA病毒检测。它通过多重靶向扩增或杂交探针捕获，精准聚焦目标病原体。相比mNGS，tNGS在理论上具有排除宿主核酸干扰的优势，使其在低浓度病原微生物检测中可能更灵敏。然而tNGS技术也面临实验操作繁琐、技术选型复杂和质量控制标准化程度低等挑战。 在tNGS/mNGS的临床应用场景选择上，《靶向高通量测序在感染性疾病中应用与实践专家共识》[2] 指出：tNGS的应用场景应与mNGS有所区别和侧重。
图1：tNGS/mNGS选择及tNGS临床解读处置流程 tNGS 技术的多维度性能评估 本次研究使用了由中国食品药品检定研究院设计研制的参考品，包含 30 种病原微生物，涵盖了细菌、真菌、DNA 病毒和 RNA 病毒等多种类型，经过梯度稀释后形成16个梯度样本(图2)。包括因美纳在内共有 11 家单位参与了本次研究，对参考品进行了检测。研究从多个维度对 tNGS 技术的选型特点及检测性能进行了评估。
图2：tNGS试剂质量评价参考品的组成和阳性符合率分布情况 共有11 款tNGS试剂符合技术资料完整性要求，且完成参考品的检测并回报数据。其中，9 款试剂的靶向技术路线为多重扩增法，2 款为探针捕获法；测序技术路线包括3 种测序平台的5款测序仪（图3）；各试剂的检测病原谱范围为30~706 个。
图 3：tNGS 检测流程各技术选型的特征 阳性符合率
11 款 tNGS 试剂的阳性符合率中位值为 88%，范围在 67%~100% 之间。对于浓度较高的参考品，仅有 2 家单位的阳性符合率达到 100%，分别是基于多重扩增技术的C1 和基于探针捕获法的C10。 在梯度稀释样本中，阳性符合率随着浓度梯度的降低而呈下降趋势，最稳定的为基于探针捕获法的C10(图4)。这意味着即使是在挑战性样本中，依旧可以对低丰度的病原微生物稳定检出，避免临床漏检和误诊。
图4：各参加单位对于所有病原微生物的总体阳性符合率及其与病原微生物浓度之间的相关性 阴性符合率
各单位反馈的11 组数据中，5 组数据的阴性符合率均为满分，占45%。6 组数据存在不同比例的假阳性情况，占55%，如图5所示。
图5：假阳性检测结果中微生物种类及数量 通过比较tNGS 与mNGS的阴性符合率发现，mNGS 假阳性主要是由背景微生物和分类错误引起，分别占比49% 和39%。而导至tNGS 假阳性的原因主要是样本交叉污染和分类错误，分别占比50% 和38%。样本交叉污染成为影响tNGS 阴性符合率的主要因素。 重复性
重复性评估结果显示，5 组数据的重复性变异系数中位值低于 50%，其他 6 组数据的变异系数分布在 50%~69%（图6）。
图6：重复性分析参考品中微生物的总体变异系数 稳健性
研究者梯度稀释样本T1~T3，T5~T7，T9~T11 和T13~T15，用于分析总体线性关系，计算参考品中各微生物报告序列数的线性相关系数r，以评估其稳健性。 根据微生物报告序列数计算的线性相关系数显示，当前的tNGS 试剂在微生物浓度与检出微生物序列数之间的关联性较低。
图 7：各参加单位对于参考品中各微生物的测序序列数与微生物浓度之间总体相关性分析 本次联合研究是国内首次针对病原 tNGS 技术开展的多中心、多平台的质量评价研究，其成果对于推动我国 tNGS 技术的规范化发展具有重要的指导意义。 研究揭示了现阶段不同 tNGS 试剂在技术选型和性能上的较大差异，为后续优化 tNGS 技术体系、提高检测性能提供了明确的方向：其反应体系和检测流程仍有较大优化提升空间，包括引物二聚体占比、抗交叉污染、重复性及稳健性等。 tNGS研究国际动态速递 除上述标准品研究之外，近期，2025年欧洲临床微生物学与感染病学会大会(ESCMID Global 2025)披露了两项研究[3,4]，分别评估了tNGS在404例ICU患者下呼吸道感染支气管肺泡灌洗液样本，和HIV阳性患者肺部感染者中149份支气管肺泡灌洗液+8份痰液样本的病原体诊断能力。 研究结果表明，在特定临床场景下，tNGS在准确性和敏感性方面显著优于传统方法，为临床诊断提供了新的技术支撑。 参考文献 1.刘东来, 王婧, 关文达, 任珊珊, 赵兰青, 鲁炳怀, 许四宏. 病原靶向高通量测序技术质量评价联合研究[J]. 中国食品药品监管, 2025, 0(3): 92-103 https://doi.org/10.3969/j.issn.1673-5390.2025.03.008 2.中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会. 靶向高通量测序在感染性疾病中应用与实践专家共识[J]. 中华医学杂志,2024,104(48)：4375-4383. 3.ESCMID 2025. Abstract ID 02371. Evaluation of the diagnostic efficacy of targeted next-generation sequencing in the detection of pathogens in bronchoalveolar lavage fluid from patients with lower respiratory tract infections in ICU. 4.ESCMID 2025. Poster ID P2220. Pathogen detection and anti-microbial resistance prediction performance of mNGS and tNGS in HIV+ pulmonary infections. |
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