说说流式的电压调节

yunchu1991

说说流式的电压调节

大多数经常自己动手跑流式的人都知道，流式细胞仪跑样品的基本操作，就是电压调节。这并非一个简单的机械步骤，而是一门融合了光学、电子学和生物学知识的艺术，是确保后续所有高级分析得以成立的基石。

那么，为什么需要调节电压呢？

一、 为什么需要调节电压？—— 寻找信号的“甜蜜点”

流式细胞仪的本质是一个极其灵敏的光信号检测系统。细胞携带的荧光素被激光激发后发出的荧光，以及细胞本身对激光的散射光，都非常微弱。这些光信号被光电倍增管（PMT）或光电二极管这类检测器捕获，并转换为电信号。

电压，直接决定了这些检测器的放大倍数（增益）。 调节电压的目的，就是为了将细胞产生的光学信号“放大”到一个恰到好处的位置，以便我们能够最清晰、最准确地进行观测和分析。这个过程就像用显微镜调焦一样，必须找到最清晰的成像平面。

不调节或错误调节电压会怎样呢？：

1. 信号过低（电压太低）： 目标信号没有被充分放大，会淹没在仪器的电子背景噪声中。导至弱阳性群体无法与阴性群体区分开，造成漏检，灵敏度急剧下降。

2. 信号饱和（电压太高）： 强阳性群体的信号强度超过了检测器的上限，所有高于此上限的信号都会被记录为同一个最大值。这就像一张过曝的照片，失去了所有高光部分的细节，无法区分表达量的真实差异。

3. 动态范围压缩： 不合适的电压会浪费检测器的动态范围。要么将弱信号压缩在底部，要么将强信号挤压在顶部，无法充分利用整个刻度来展示细胞群体从阴性到强阳性的完整分布。

4. 数据不可比： 今天设置的电压和明天设置的如果不一样，那么两次实验的数据完全没有可比性，实验的可重复性无从谈起。

因此，调节电压的终极目标是为每一个检测通道找到一个“甜蜜点”，使得阴性群体的信号清晰地位于检测背景之上，而所有阳性信号（包括弱阳和强阳）都完整地分布在检测器的线性动态范围之内，从而最大化数据的分辨率和信息量。

二、 电压调节的基础：认识FSC与SSC

电压调节并非盲目进行，而是基于对细胞固有物理参数的观测。其中，前向散射光（FSC） 和 侧向散射光（SSC） 是两个最重要的基础参数，是所有流式实验的“地图”和“罗盘”。

1. 前向散射光（Forward Scatter, FSC）

· 物理意义： 激光照射细胞后，沿着激光原方向小角度（通常0.5-10°）散射的光。其信号强度与细胞的大小/体积近似成正比。细胞越大，阻挡的光线越多，FSC信号就越强。

· 检测器： 通常由光电二极管检测，因为信号较强。

· 作用：

o 区分大小不同的细胞： 例如，在血液样本中，可以根据FSC初步区分淋巴细胞（小）、单核细胞（中）和粒细胞（大）。

o 设定阈值： 用于设置阈值，排除微小的电子噪声和细胞碎片（FSC极低），确保只采集细胞事件。

o 电压调节基础： 首先调节FSC电压，使目的细胞群落在合理的线性范围内（通常为10^1 – 10^3）。

2. 侧向散射光（Side Scatter, SSC）

· 物理意义： 激光照射细胞后，向侧面90°方向散射的光。其信号强度与细胞的内部颗粒度和结构复杂性（如细胞器、核形、颗粒内容物）成正比。细胞内部越不规则、颗粒越多，SSC信号就越强。

· 检测器： 通常由更灵敏的光电倍增管（PMT）检测。

· 作用：

o 区分细胞内部结构： 例如，粒细胞因含有大量颗粒而具有高SSC，淋巴细胞内部简单则SSC低，单核细胞介于两者之间。

o 与FSC联用进行细胞分群： FSC vs SSC散点图是流式实验最经典、最重要的起始图。通过这张图，可以初步将混合细胞群体中的不同细胞亚群区分开来，并圈定（设门）后续要分析的目标细胞（如淋巴细胞门）。

o 电压调节基础： 在调节好FSC电压后，调节SSC电压，使目标细胞群在FSC-SSC图中清晰分群，并位于刻度中部。

FSC和SSC是细胞固有的物理参数，无需任何荧光染色即可检测。它们为我们提供了样本的“地形图”，是后续所有荧光分析的基石。调节它们的电压，就是为了绘制出一张比例尺最合适、地物最清晰的地图。

三、 实验举例：人外周血淋巴细胞亚群分析的电压调节步骤

让我们以一个常见的实验——人外周血单个核细胞（PBMC）中CD4+和CD8+ T细胞分析——为例，详细阐述电压调节的步骤。

实验目标： 使用抗CD3-FITC, CD4-PE, CD8-APC抗体，分析淋巴细胞中CD4+和CD8+ T细胞的比例。

样本准备： 未染色PBMC样本（阴性对照）、单染样本（用于补偿）、完全染色样本。

步骤一：建立细胞“地图”，调节FSC和SSC电压

1. 上样未染色PBMC。

2. 在FSC vs SSC散点图中，所有信号可能会挤在一团。

3. 调节FSC电压： 逐步增加或降低电压，使主要细胞群体（你会看到淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三个cloud）在X轴上分布开来，使淋巴细胞群的中心大约落在10^2 – 10^3的线性刻度上。避免细胞群体触及坐标轴最左侧（电压太低）或最右侧（电压太高饱和）。

4. 调节SSC电压： 保持FSC电压不变，调节SSC电压，使细胞群体在Y轴上展开，使淋巴细胞群的中心落在10^2 – 10^3的线性刻度上。此时，你应该能看到经典的三群细胞：左下角的淋巴细胞（小且简单）、中间的单核细胞（中等待大小和复杂度）、右上角的粒细胞（大且复杂）。

5. 绘制淋巴细胞门： 在FSC-SSC图上，围绕淋巴细胞群体画一个“门”（Gate），称为“淋巴门”。后续的荧光分析将主要集中在这个门内的细胞上，以排除其他细胞的干扰。

步骤二：设定荧光背景基线，调节荧光通道电压

1. 确保所有荧光通道的电压都处于初始较低状态。

2. 在 histogram 图中观察各荧光通道（FITC, PE, APC）的未染色细胞信号。它应该是一个紧贴Y轴的低矮峰。

3. 逐步增加某个荧光通道（如FITC）的电压，直到这个阴性峰完全脱离坐标轴左侧，其峰底清晰地坐落在10^0 – 10^1的对数刻度之间。这意味着信号已被充分放大到背景噪声之上，但又没有过度放大。

4. 用同样的方法，依次调节PE和APC通道的电压，使它们的阴性群体也处于相同的位置。

o 关键原则： 使用未染色样本来设定所有荧光通道的阴性背景位置。确保所有通道的阴性峰在各自 histogram 上的位置基本一致，这为后续准确区分阴阳性奠定了统一的基础。

步骤三：验证与微调

1. 上样单阳补偿样本（如CD4-PE单染样本）。

2. 观察PE通道：阳性群体应该清晰可见且没有饱和（峰值最好在10^3 – 10^4对数刻度之间）。如果阳性信号太强导至饱和，应微降低PE电压；如果阳性信号太弱，与阴性峰分离不开，应微增加PE电压。

3. 同时观察其他通道（如FITC和APC）：你会看到PE的信号在这些通道上有“渗漏”（由于荧光光谱重叠），这正是后续需要进行补偿校正的基础。此时电压调节的目标是确保阳性信号有足够的强度且在线性范围内，以便计算准确的补偿值。

4. 对所有荧光通道重复此验证步骤。

完成以上步骤后，电压就设置完成了。 此时，你可以保存这个实验设置模板（Template），以便下次同类实验直接调用，保证数据的一致性。然后开始采集真正的实验样本，并应用补偿矩阵进行最终分析。

结论

电压调节绝非一蹴而就的简单操作，而是一个严谨、迭代的过程。它要求实验者深刻理解FSC/SSC的生物学意义、荧光检测的原理以及数据可视化的需求。掌握了这门“艺术”，就意味着你为流式实验数据的质量上了第一道，也是最重要的一道保险，从而能够自信地从细胞中精准地捕捉科学发现。